着丝粒蛋白F mRNA在肺腺癌细胞系、肺腺癌组织中的表达变化及相关调控信号通路分析

王建松，王卫敏，蒋仲敏

(1 潍坊医学院，潍坊261053；2山东省千佛山医院)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，占所有恶性肿瘤发病率的11.6%，更是癌症相关死亡最常见的原因，占癌症相关死亡总数的18.4%[1]。肺腺癌是最常见的肺癌组织学类型，约占所有肺癌的40%，肺腺癌起源于分泌黏液的小气道上皮—Ⅱ型肺泡细胞，复杂性和异质性均较高[2]。表皮生长因子受体(EGFR)、c-ros肉瘤致癌因子(ROS1)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等编码激活肿瘤信号分子的癌基因可驱动肿瘤的增殖及促进肿瘤生长，是目前肺癌靶向药物针对的主要靶点[3]。但靶向药物与传统细胞毒药物一样，可导致肿瘤耐药，最终影响治疗效果[4]。研究肺腺癌的分子水平变化，筛选新的有效生物标志物，对延长并改善肺腺癌患者的生存预后十分重要。着丝粒蛋白F(CENPF) 是一种含有3 210个氨基酸的着丝粒蛋白，在有丝分裂着丝点形成和着丝粒组装中发挥重要作用[5]。CENPF以细胞周期依赖的方式表达，调控染色体的分离[6]。CENPF在肝癌、结直肠癌、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达均升高，且与患者的不良预后相关[7～13]。CENPF能够与Forkhead家族转录因子叉头框蛋白(FOXM1)协同调节靶基因的表达，激活前列腺癌恶性相关的关键信号通路，促进前列腺癌细胞的增殖、转移等[11]。目前，CENPF被普遍认为是癌基因，然而关于其与肺腺癌的关系尚未见报道。2018年3～10月，我们观察了CENPF mRNA在肺腺癌细胞系中的表达变化，分析了CENPF mRNA在肺腺癌组织中的表达变化并探讨其相关调控信号通路，旨在为阐明CENPF在肺腺癌发生、发展中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 肺正常上皮细胞系BEAS-2B和肺腺癌细胞系(A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，均常规培养于RPMI-1640完全培养基中(含10% FBS和1%青链霉素)，置于一定湿度、37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱培养。每2天更换培养基1次，3～5天传代1次。严格无菌操作，每天观察，避免污染。

RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、青链霉素购自美国Gibco公司，TRIzol购自美国Invitrogen公司，cDNA逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司。qPCR引物由上海生工生物公司合成，总RNA纯度和浓度测定采用美国Merinton SMA1000微量分光光度计，qPCR采用美国伯乐CFX96荧光定量PCR仪。

1.2 肺腺癌细胞系、肺正常上皮细胞系CENPF mRNA检测 采用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)法。每1106细胞加入1 mL TRIzol，依据TRIzol说明书提取各细胞系总RNA，微量分光光度计检测总RNA的纯度及浓度。取2 g总RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green实时定量PCR的方法检测CENPF mRNA。CENPF上游引物序列为5′-TACAACGAGAGAGTAAGAACGC-3′，下游引物序列5′-CTACCTCCACTGACTTACTGTC-3′；内参GAPDH上游引物序列5′- CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3′，GAPDH下游引物序列5′- ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3′。qPCR反应条件为95 ℃ 30 s预变性后，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环，并添加溶解曲线。以GAPDH为内参照，以2-ΔΔCt代表CENPF mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 肺腺癌组织中CENPF mRNA表达分析 采用TCGA分析CENPF mRNA表达与肺腺癌临床病理参数、预后的关系，TCGA肺腺癌数据集表达谱及临床病理特征数据下载自Broad GDAC Firehose(http://gdac.broadinstitute.org/)，表达谱数据进行对数(以2为底)转换。肺腺癌CENPF mRNA表达数据集中共纳入515例肺腺癌癌组织、59例癌旁正常组织。其中13例患者无明确生存期信息和分期信息，在进行CENPF表达与肺腺癌临床病理特征、预后相关分析时去除。502例肺腺癌患者中，女271例、男231例，TNM分期Ⅰ～Ⅳ期分别为270、126、81、25例，Kaplan-Meier生存曲线分析CENPF高、低表达者预后。Cox比例风险回归模型分析CENPF mRNA表达对肺腺癌患者预后的影响。

1.4 肺腺癌组织中CENPF mRNA表达相关信号通路分析 采用基因集富集分析(GSEA)法分析受CENPF调控的肺腺癌相关信号通路。采用GSEA软件(3.0版本)分析TCGA肺腺癌数据集。根据CENPF mRNA表达水平的中位数，将肺腺癌组织样本分成高表达和低表达两组，以Hallmark基因集(6.2版本)为参照基因集，按照GSEA软件默认参数进行GSEA分析。

2 结果

A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975、BEAS-2B细胞CENPF mRNA相对表达量分别为4.333±0.271、3.193±0.188、2.770±0.091、5.491±0.249、1.006±0.071，A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975细胞CENPF mRNA相对表达量均高于BEAS-2B(P均<0.05)。

502例份肺腺癌组织、59例份癌旁正常组织CENPF mRNA的相对表达量分别为9.632±0.059、6.472±0.093，二者比较，P<0.001。502例中CENPF高、低表达者各251例。CENPF mRNA表达与肺腺癌患者M分期、肿瘤解剖部位无关(P均>0.05)，与患者的性别、年龄、T分期、N分期及TNM分期相关(P均<0.05)，见表1。

表1 CENPF mRNA表达与502例肺腺癌患者临床病理参数的关系(例)

CENPF mRNA高、低表达者的生存期分别为(2 404.85±306.04)、(3 070.71±344.08)d，中位生存期分别为1 235和1 632 d(χ2=10.26，P=0.001)。

CENPF mRNA表达 (HR=1.503，P=0.006)、T分期 (HR=1.507，P<0.001)、N分期(HR=1.682，P<0.001)、M分期(HR=2.204，P=0.003)及临床TNM分期(HR=1.666，P<0.001)与患者的预后相关；对上述对预后有影响的因素进行Cox多因素回归分析结果显示，CENPF mRNA表达 (HR=1.414，P=0.022)及临床TNM分期(HR=1.667，P=0.004)是影响肺腺癌患者预后的因素。 与CENPF mRNA高表达有关的肺腺癌调控信号通路有G2M检查点(P<0.001，FDR<0.001)、有丝分裂纺锤体(P<0.001，FDR<0.001)、E2F靶基因(P<0.001，FDR<0.001)、MYC 靶基因(P<0.001，FDR=0.001)、mTOR信号通路(P=0.002，FDR=0.005)、精子形成(P=0.002，FDR=0.009)、未折叠蛋白反应(P=0.002，FDR=0.020)及PI3K/Akt/mTOR 信号通路(P=0.015，FDR=0.117)。

3 讨论

肺癌是癌症死亡最常见的原因，全球每年约210万新发病例和180万死亡病例[1]。肺腺癌是其最常见的组织学类型之一，在不吸烟患者和女性患者肺癌中所占比重较高[2]，肺腺癌仍是最具侵袭性和最致命的肿瘤类型之一，五年生存率仅为16.1%[13]。肺腺癌是高度复杂和异质性的包含多种基因改变亚型的疾病，近年来，驱动肺腺癌发生发展的多个驱动基因被发现，并被开发为靶向药物，改变了临床上肺腺癌诊疗的方式。尽管靶向治疗显示出了非常大的希望，然而已经识别的这些靶点仅占患者总数的不到50%[2]，同时，几乎所有的患者最终都由于获得耐药性而导致靶向治疗失败[4]。因此筛选新的有效的生物标志物，对延长并改善肺腺癌患者生存十分重要。

CENPF基因位于1号染色体(1q41)，其编码的蛋白参与细胞周期、染色质分离等生物学过程，在细胞周期中，CENPF缓慢累积，在G2/M期达到峰值，之后随着有丝分裂的完成快速下降[6]。近年来的研究显示，CENPF在肝癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达升高，且与患者不良预后相关[7, 11]。CENPF在恶性肿瘤中的高表达可能是由于基因扩增所致，肝癌中30%样本有CENPF基因扩增[14]，CENPF过表达与血清AFP、血管侵犯、低分化等相关，功能实验发现沉默CENPF能够降低细胞增殖能力，下调细胞周期蛋白依赖性激酶(cdc2)和细胞周期蛋白B1(cyclinB1)，导致细胞周期暂停于G2/M期[7, 15]。这与本研究中证明CENPF mRNA高表达富集了G2M检查点是相吻合的。CENPF在前列腺癌中亦显著高表达，CENPF与前列腺癌Gleason评分、TNM分级、远处转移、不良预后等相关[11]。CENPF与FOXM1相互作用，协同调节靶基因表达，激活前列腺癌恶性相关关键信号通路，促进前列腺癌生长[16]。研究还显示miR-101、鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)、FOXM1、CENPF信号通路与前列腺癌的侵袭、转移、去雄耐药等紧密相关[17]。

本研究首先通过qPCR检测肺腺癌细胞系和肺正常细胞系CENPF mRNA的表达差异，发现CENPF mRNA在多种肺腺癌细胞中表达均明显升高，通过分析TCGA肺腺癌数据集中的515例肺腺癌组织和59例癌旁正常组织表达谱数据，我们发现CENPF mRNA在肺腺癌组织中表达也是显著升高的，与在细胞中发现的结果相一致。据此我们认为CENPF可能是促进肺腺癌发生的癌基因。通过分析CENPF mRNA表达与肺腺癌患者各临床病理特征间的关系发现，CENPF mRNA表达与肺腺癌T分期、N分期、TNM分期等均相关，肿瘤的恶性程度越高，CENPF mRNA的表达水平越高，说明CENPF与肺腺癌的恶性程度及疾病进展相关，这与其在前列腺癌等肿瘤中的研究结果相一致[16]。

Kaplan-Meier生存分析结果显示CENPF mRNA高表达的肺腺癌患者的生存期短于低表达患者，Cox比例风险回归模型分析结果显示，CENPF mRNA高表达是影响肺腺癌患者预后的独立影响因素，以上结果均提示CENPF有可能作为临床预后指标。通过GSEA分析探究其可能的机制，CENPF mRNA高表达与G2M检查点、有丝分裂纺锤体、E2F靶基因、MYC 靶基因、mTOR信号通路、精子形成、未折叠蛋白反应、PI3K/Akt/mTOR 信号通路等基因集相关，上述信号通路均是与肿瘤发生、侵袭转移等密切相关的信号通路[19]，说明CENPF可能通过上述信号通路影响肺腺癌的发生和发展。尽管本研究在细胞和大样本组织上阐明了CENPF与肺腺癌的相关关系，然而，由于这些结果都是基于mRNA水平上的进一步研究，尚需免疫组化、蛋白质芯片等蛋白水平上的研究进行佐证。

综上所述，肺腺癌组织及细胞系中存在CENPF高表达，CENPF高表达与肺腺癌患者的恶性病理特征及不良预后密切相关。CENPF mRNA高表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素。CENPF可能通过调节G2M检查点、有丝分裂纺锤体、E2F靶基因、MYC 靶基因、mTOR信号通路)、精子形成、未折叠蛋白反应及PI3K/Akt/mTOR 信号通路，在肺腺癌的发生、发展中起重要作用。