多囊卵巢综合征患者血清外泌体中差异表达microRNAs及其功能分析

王洁，王倩，崔趁趁，牛力华，梁琳琳，张翠莲

(郑州大学人民医院·河南省人民医院，郑州450003)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育龄期女性常见的一种生殖内分泌紊乱性疾病，发病率高达5%～10%[1]。PCOS主要临床症状为月经异常(稀发或闭经)、多毛、痤疮、肥胖、不孕等，远期并发症包括高血压、高血脂及心血管疾病、糖尿病等，严重危害女性的身心健康[2]。目前PCOS的发病机制尚不明确，探索PCOS的发病机制已成为生殖医学领域研究的热点。外泌体是细胞通过胞吞胞吐作用分泌的一种膜性囊泡，广泛分布于血清、血浆、卵泡液、唾液、尿液、乳汁、腹水等多种体液中，直径30～250 nm[3]。外泌体包含mRNA、microRNAs(miRNAs)、长链非编码RNAs、蛋白质、脂质等多种生物活性物质[4]。作为一种新型的细胞间沟通媒介，外泌体可通过将蛋白质、mRNA和miRNAs等分子传递到靶细胞中而在细胞通讯过程中发挥重要作用。目前关于PCOS患者血清外泌体miRNAs表达情况相关报道较少。2017年11月～2018年6月，我们分析了PCOS患者血清外泌体中差异表达miRNAs，并进一步分析血清外泌体中差异表达miRNAs的功能，以期为PCOS发病机制的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择河南省人民医院生殖医学中心行体外受精—胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者，据鹿特丹标准诊断为PCOS患者30例为实验组，年龄(28.27±2.77)岁。纳入标准：年龄<35岁，双侧窦卵泡数>5～7个，既往6个月内未行激素替代治疗，排除糖尿病、高胰岛素血症、库欣综合征、甲状腺功能障碍、高泌乳素血症等内分泌疾病。因单纯输卵管因素不孕的患者30例为对照组，年龄(29.27±2.88)岁。两组年龄等一般资料具有可比性。本研究经河南省人民医院伦理委员会批准，纳入者或家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 ExoquickTM外泌体提取试剂盒(SBI，美国)，RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen，德国)，miScript PCR Starter Kit试剂盒(Qiagen，德国)，兔CD63抗体(abcam，英国)，兔CD9抗体(Abcam，英国)，兔α-tubulin抗体(Abcam，英国)，抗兔二抗(Abcam，英国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，透射电子显微镜(JEOL，日本)，qRT-PCR仪(Roche，瑞士)。

1.3 两组血清外泌体提取 两组分别于月经周期第2～4天抽取外周血5 mL，3 000 rpm离心20 min，取血清保存于-80 ℃备用。采用SBI公司的ExoquickTM外泌体提取试剂盒提取外泌体，将500 μL冷冻血清于冰上融化，3 000 g离心15 min去除细胞碎片，按说明书加入外泌体提取试剂，4 ℃静置30 min，1 500 g离心30 min，去除上清，注意不要触碰底部沉淀，再次1 500 g离心5 min，去上清，100 μL的PBS重悬，-80 ℃备用。取PBS重悬的外泌体悬液20 μL，滴于载样铜网上，室温静置2 min，用滤纸从滤网侧边吸干液体，用3%磷钨酸溶液30 μL在室温下负染5 min，滤纸吸干负染液，白炽灯烤干，将铜网安装于样品槽中，透射电镜拍照观察。镜下可见外泌体是直径30～250 nm的圆形或椭圆形膜性囊泡，有双层膜性结构，可单个分布，也可成群聚集分布的形态及大小。考马斯亮蓝染色剂染色、Western Blotting法检测外泌体表面特异性蛋白CD9、CD63，所有操作均严格按照使用说明书进行。结果显示两组血清外泌体中均存在CD9、CD63。

1.4 两组血清外泌体miRNAs检测及差异表达血清外泌体miRNAs筛选 取两组外泌体样品，冰上解冻后，严格按照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书的操作步骤提取血清外泌体miRNAs，使用华大基因公司的BGISEQ500测序平台进行质检。高通量测序法定性、定量检测两组血清外泌体miRNAs，所有操作均严格按照使用说明书进行。采用差异检验方法(两组差异表达倍数≥2且P<0.01即可判定为差异表达血清外泌体miRNAs)筛选出两组差异表达的血清外泌体miRNAs。

1.5 差异表达血清外泌体miRNAs功能分析 将“1.4”中差异表达血清外泌体miRNAs导入富集分析工具Enrichr进行生物信息学分析。对差异表达血清外泌体miRNAs进行GO富集分析及KEGG功能注释，揭示差异表达血清外泌体miRNAs的功能。

1.6 两组血清差异表达外泌体miRNAs检测 最终筛选出10条差异表达血清外泌体miRNAs。取两组血清，qRT-PCR法检测差异表达血清外泌体miRNAs。采用miScript PCR Starter Kit试剂盒和 Light Cycler 96 仪器进行 qRT-PCR 定量检测，实验采用20 μL反应体系，扩增条件：95 ℃变性15 min，循环条件为95 ℃15 s，55 ℃30 s，70 ℃ 30 s，共进行45个循环。内参基因选用U6，各miRNAs引物序列见表1。以2-△△Ct代表目的miRNAs的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

表1 10种差异性表达miRNAs的引物序列

2 结果

PCOS患者血清外泌体差异表达miRNAs共有243条，其中表达上调115条、下调128条，部分数据见表2。GO分析及KEGG功能注释结果发现，PCOS患者差异表达血清外泌体miRNAs的功能与类固醇激素的合成有关，可能参与调节胰岛素信号受体通路。

实验组miR-146a-5p、miR-25-5p、miR-27a-3p、miR-93-5p、miR-23a-3p、miR-223-5p、miR-25-3p、miR-483-5p、miR-383-5p相对表达量分别为5.970±0.370、11.150±0.150、6.423±0.198、6.085±0.115、2.794±0.094、9.970±0.470、1.900±0.100、8.398±0.343、8.320±0.420，对照组分别为3.500±0.420、9.645±0.145、4.220±0.190、3.750±0.050、0.424±0.024、6.110±0.110、-0.055±0.015、4.423±0.248、4.435±0.235，组间比较，P均<0.05。实验组、对照组miR-141-3p相对表达量分别为8.993±0.008、8.993±0.008(P>0.05)。

3 讨论

miRNA是广泛存在于真核生物中的一种短链非编码RNA，可被微囊泡包裹也可以游离存在[5]。miRNA主要在转录后与下游靶基因结合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，因此在调控发育过程中起着重要作用。研究[6]表明，miRNA表达改变可能会参与PCOS疾病的发生过程，在一定程度上会影响患者卵母细胞质量，可造成不孕及引发后续不良助孕结局。外泌体可在细胞间传递生物学信息，实现细胞间的物质交换和信号交流。外泌体囊泡结构可保护其中的miRNAs，防止其降解而维持其在血液中的生物学稳定性，并可选择性的传递miRNAs至靶细胞中，改变受体细胞基因的表达[5]。研究[7,8]表明外泌体及其miRNAs在肿瘤等疾病的早期诊断和分子机制中发挥着重要的作用。本研究从外泌体的角度出发，研究了miRNA在PCOS的发生发展中可能发挥的作用。

表2 两组差异表达血清外泌体miRNA比较

本研究主要以血清外泌体miRNAs为研究对象，采用透射电镜和Western blotting法对外泌体的形态及表面特异性蛋白分子进行鉴定，经检测发现采用ExoquickTM试剂盒于血清中分离出的提取物符合文献[6,9]对外泌体形态及特征的描述。根据高通量测序结果及miRNAs的功能[10～13]筛选出hsa-miR-141-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-25-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-383-5p等10条差异性表达miRNAs进行进一步验证。研究[14,15]认为，以上miRNAs可能与胰岛素抵抗的发生、颗粒细胞的增殖凋亡及卵泡激素的合成有关。据报道[10]，miR-146a-5p可参与胰岛素信号传导途径，通过作用于胰岛素受体在脂肪形成的过程中发挥重要的作用；miR-93-5p可以靶向作用于GLUT4，在PCOS患者以及有胰岛素抵抗的非PCOS患者脂肪组织中表达上调，这可能会在胰岛素抵抗特别是PCOS患者胰岛素抵抗的发生中扮演重要的角色[14]。而本研究发现，PCOS患者血清外泌体miR-146a-5p、miR-93-5p相对表达量升高，这可能会为PCOS肥胖和胰岛素抵抗发病机制的研究提供新思路。

研究[11]发现，miR-27a-3p，miR-483-5p在PCOS患者颗粒细胞中均表达上调，在调控颗粒细胞增殖凋亡上发挥着重要的作用；进一步将miR-27a-3p转染KGN细胞系发现miR-27a-3p可以促进KGN颗粒细胞凋亡，抑制其增殖，同时还发现PCOS患者颗粒细胞中miR-27a-3p的过表达可能与其血清睾酮的升高有关。Seger等[12]研究发现PCOS卵丘颗粒细胞中miR-483-5p可作用于MAPK3使其表达下调，从而参与MAPK途径诱导的颗粒细胞的发育、分化和增殖，还可能负调控PCOS卵泡激素合成。Xu等[6]发现在PCOS患者卵丘颗粒细胞中，高表达的miR-483-5p抑制Notch3和MAPK3蛋白表达，从而阻断Notch信号通路和MAPK信号途径，抑制卵丘颗粒细胞增殖、分化，促进颗粒细胞凋亡。研究[13,14]表明miR-23a也在调控细胞凋亡中发挥重要的作用，可以通过抑制XIAP的表达，促进滋养层细胞的凋亡；也可以靶作用于SMAD5促进颗粒细胞的凋亡[15，16]。本研究中PCOS组血清外泌体miR-27a-3p、miR-23a、miR-483-5p相对表达量均上升，可能会在一定程度上调控PCOS患者颗粒细胞的增殖凋亡以及卵泡激素的合成，导致PCOS的发生发展，这将会为我们研究PCOS可能的诊断方法和发病机制提供一定的思路和分子基础。

综上所述，PCOS患者血清外泌体hsa-miR-378d、hsa-miR-378b、hsa-miR-4772-3p等表达上调，hsa-miR-5090、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-6836-5p等表达下调。PCOS患者差异表达血清外泌体miRNAs与类固醇激素的合成有关，可参与调节胰岛素信号受体通路。