耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究

李飞 李丽娟 梁德志 王凤平 张拔山

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是临床最常见的机会致病菌之一，在非发酵革兰阴性菌中其分离量占第一位（45.4%）[1]。曾经认为亚胺培南是用于治疗铜绿假单胞菌感染最有效的临床药物，随着抗生素选择压力增加，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药情况日趋严重，常呈多重耐药，给临床抗感染治疗带来了新的挑战，使得临床抗感染治疗的难度大大增加[2-5]。耐亚胺培南铜绿假单胞菌（imipenem resistancePseudomonas aeruginosa，IMPRPAE）的耐药机制国内外进行了大量研究，发现碳青霉烯类耐药机制主要包括以下几个方面：碳青霉烯酶的产生、AmpC酶、ESBLs、外膜孔蛋白缺失和外排泵超表达等。本研究选取2016年1月至2017年12月东莞地区2家医院临床送检标本110株IMPRPAE，从MBLs基因检测，oprD基因检测以及oprDmRNA表达水平检测三方面着手，分析其耐药特征以及耐药机制。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

选取2016年1月至2017年12月东莞市人民医院及东莞市东华医院临床送检标本分离的110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌，送检标本类型包括痰液、尿液、血液、分泌物等。所有标本保存于脱脂牛奶，-70℃保存。同一患者分离得到的菌株不重复计入。实验时把菌株从脱脂牛奶复苏到血平板，再从血平板中挑取纯菌株的单个菌落备用。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器设备与试剂

VITEK-2全自动细菌鉴定/药敏系统购自法国生物梅里埃公司；bioMérieux DENSIMAT比浊仪购自法国生物梅里埃公司；CHEF-DRIII电泳仪购自美国生物伯乐公司。RNA提取试剂盒购自LIFE公司；BestarTMqPCR RT Kit试剂盒购自上海星汉生物科技公司；细菌鉴定卡（GN）以及药敏卡（AST-GN10）购自广州市番禺华鑫科技有限公司；40U SpeI购自大连生物工程公司，DNA提取试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2.2 药敏方法

所有菌株均以VITEK-2全自动细菌鉴定分析仪鉴定到种。根据2016年美国临床和实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）规定的常规药敏试验标准[6]，选择AST-GN10药敏卡上的氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、复方新诺明16种抗生素进行药敏试验。使用纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B法）进行美罗培南药敏试验。其中美罗培南的判断折点主要依据CLSI判断标准[7]：抑菌圈直径≥19 mm为敏感，抑菌圈直径＝16～18 mm为中介，抑菌圈直径≤15 mm为耐药。

1.2.3 脉冲凝胶电泳（plused field gel electrophoresis，PFGE）

挑取单菌落接种营养平板，37度孵育过夜。用bioMérieux DENSIMAT比浊仪调整细菌悬液浓度，使浊度为3.8～4.2。加入1%Seakem Gold胶，混匀制备胶块。使用含蛋白酶K的细胞裂解液（cell lysis buffer，CLB）消化2 h。纯水清洗胶块2次；TE（10 mmol/L Tris：1 mmol/L EDTA，pH 值 8.0）清洗胶块4次。使用40 U SpeI内切酶进行酶切，在37℃孵育4 h。在CHEF-DRIII电泳仪中进行脉冲场电泳。电泳参数为 5 s～15 s，9 h；15 s～50 s，9 h。电泳结束后，使用GelRed核酸染料染色。在读胶仪中成像，并转换成TIFF图像格式保存。PFGE图像录入BioNumerics软件包进行处理，识别图像条带，经统一的分子质量标准，进行聚类，构建聚类树。分子量标准用沙门菌H9812经过XbaI酶切后的片段。

1.2.4 PCR扩增

MBLs基因以及oprD基因应用Oligo 7软件（Molecular Biology Insights，Inc.Co，美国）设计引物，委托上海赛默飞世尔科技公司合成，相关基因的引物序列见表1，引物设计参考国内外现有的文献报道[8-10]。PCR扩增体系为：2.5 μL 10×Taq Buffer（20 mM Mg2+），0.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），DMSO 2.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL（1.5 U/μL），DNA模板50～100 ng，ddH2O补足至25 μL。MBLs的热循环参数为：94℃预变性5 min后，30个循环：94℃变性30 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，最后 72℃延伸5 min后扩增完毕。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以100 bp DNA Marker为标准确定位点分子质量，空白水为阴性对照，出现与目的产物分子相当的条带为阳性。oprD的热循环参数为：95℃预变性10 min，30个循环：95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸 10 min后扩增完毕。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以100 bp DNA Marker为标准确定位点分子质量，以标准菌株ATCC27853作为阳性对照。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used for gene amplification

1.2.5 Sanger测序基因测序和分析

纯化PCR扩增产物，产物送上海Invitrogen公司进行测序。oprD测序产物分别在假单胞菌基因组网站（www.pseudomonas.com）和 NCBI网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对分析获得的序列，分析其突变情况。MBLs测序产物与NCBI网站（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi））比对分析获得序列。

1.2.6 荧光定量PCR（real time quantitative-PCR，qRT-PCR）检测oprD因mRNA的表达

按照RNA提取试剂盒说明书提取PA的总RNA。RNA定量后，取等量RNA反转录成cDNA。使用BestarTMqPCR RT Kit试剂盒进行目的基因oprD基因mRNA的检测，管家基因rpsL作为内参。oprD基因mRNA的相对表达量通过与标准PAO1菌株做比较。oprD基因mRNA表达量减少与标准PAO1菌株相关，即标准PAO1菌株oprD基因mRNA表达量被赋值为1.0，若其他菌株oprD基因转录水平小于其70%时，被认为其表达量减少[11]。并且选取10株亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌均同时检测其oprD基因mRNA表达量。所有实验重复3次。PCR引物的核苷酸序列见表2。

表2 PCR引物序列Table 2 Primers used for gene amplification

2 结果

2.1 IMPRPAE耐药特点

IMPRPAE对阿米卡星的耐药率为10.00%，对妥布霉素、庆大霉素、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率在17.27%～21.82%，对头孢他啶、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率26.36%～31.82%，对其余β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、磺胺类抗菌药物耐药严重，结果见表3。

2.2 IMPRPAE的流行病学分析（PFGE）

本研究调查了110株PA，所有分离菌株对亚胺培南耐药。而对美罗培南敏感或中介的菌株共32株（29.09%），其中敏感株14个，中介株18个，判断标准依据美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）规范化操作。

110株PA PFGE聚类图见图1。110株菌分为84个不同的带型，其中70个带型只包含1株菌，即有70株菌具有独特的PFGE带型。总的来说，PFGE显示其具有高度克隆多样性（如图1），尽管有一个包含菌株最多的带型包含5株。

2.3 PCR法分析MBL基因和oprD基因以及其测序结果

经PCR扩增后发现110株IMPRPAE中产MBLs阳性菌株共有18株，阳性菌株进行基因测序，测序结果直接在GenBank中进行序列对比分析，发现有9株检出是IMP-25，8株检出是VIM-2，4株检出是SIM-2，有3株同时检出即有VIM-2又有SIM-2。分别与IMP-25GenBank注册号EU352796，VIM-2GenBank注册号AF191564以及SIM-2GenBank注册号KT013203相同。

表3 IMPRPAE对常用抗菌药物的药敏率（%）（n=110）Table 3 Sensitivity of imipenem-resistant pseudomonas aeruginosa to frequently-used antimicrobial drugs（%）（n=110）

110株PA菌中107株oprD基因扩增阳性，3株阴性，缺失率为2.73%。阳性菌株基因测序表明其中7株无中断突变，84株伴有移码突变，16株伴有一个碱基单点突变而致终止密码子提前出现（表4）。移码移位所致突变其中共有8株伴有IS序列插入，主要发现了ISPpu29、ISPpu21、IS1394以及ISPst2 4种插入序列类型。

2.4 qRT-PCR检测oprD基因mRNA的表达结果

检测 7株（编号为：5，11，18，23，43，81和107）无中断突变株其oprD的mRNA表达水平。与PAO1相比，所有菌株oprD表达量降低（从0.06到0.65）（表5）。对10株亚胺培南敏感的PA其oprD的表达也进行了检测，发现没有任何一个菌株其oprD表达量降低，其范围从1.23到12.94。

图1 110株PA PFGE聚类图Figure 1 Dendrogram based on PFGE profiles of imipenemresistant PA isolates

表4 IMPRPAE oprD基因突变类型Table 4 The types of oprD gene mutation in IMPRPAE

3 讨论

目前，临床已广泛使用亚胺培南用于治疗感染铜绿假单胞菌，使得越来越多的耐亚胺培南铜绿假单胞菌产生了耐药性[12]。2015年一项荟萃分析研究显示[13]，铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药率在8.7%至50.4%之间。中国细菌耐药监测网报告2016年铜绿假单胞菌对各种抗菌药物的耐药性仍处于较高水平[4]。本组研究发现110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感率较高达87.27%，而对其他药物耐药率都很高，甚至有7种药物耐药率在90%以上，由此可知铜绿假单胞菌的耐药情况已十分严峻，对于在临床诊疗过程中应重视和加强对细菌耐药性的监测，并合理地应用和优先选用低耐药可能性的抗菌药物，减少耐药菌株在院内的扩散。

表5 无中断突变株其oprD基因的mRNA表达水平Table 5 The mRNA expression of the oprD gene without disrupted mutation

铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类药物的耐药机制较为复杂，其中最主要的耐药机制包括以下几个方面：①产碳青霉烯酶：铜绿假单胞菌中常见的碳青霉烯酶为金属β-内酰胺酶。目前发现的获得性金属β-内酰胺酶包括：IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM9种，其中以IMP和VIM常见[14-15]。本研究110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中发现18株（16.36%）耐药菌株携带金属β-内酰胺酶，主要包括IMP-25，VIM-2，SIM-2，这也说明了金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中发挥重要作用。多项研究结果发现金属β-内酰胺酶基因检测阳性率均低于20%[17-18]。而方小龙等研究发现2013年至2015年深圳地区金属β-内酰胺酶基因检测阳性率32.8%结果较不一致[15]。本组研究发现金属β-内酰胺酶基因的存在以及产生金属酶是本地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一，可能还存在其他主要耐药机制。②外排泵高表达：铜绿假单胞菌染色体上存在多种外排泵基因，外排泵可将多种有毒物质、药物等排出细菌体内；正常情况下外排泵表达较低，对碳青霉烯耐药性无影响，但外排泵高表达时，可引起对亚胺培南及美罗培南的外排增加，从而增加其耐药性[2]。③外膜通透性降低：铜绿假单胞菌外膜通透性低，碳青霉烯无法直接通过其外膜，需借助外膜上的孔道蛋白oprD进入细菌发挥作用，因此外膜蛋白oprD缺失或表达降低都会导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯的耐药性增加[18-19]。本研究110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中发现oprD缺失的有3株（2.73%），与这与颜英俊等[20]报道结果一致。相关文献报道oprD缺失是PAE对IMP耐药的主要机制，例如闫玉兰等人[6]发现oprD缺失率高达86.8%。而也有相关报道发现oprD缺失率较低，例如广东中山地区王娟等人[21]发现oprD缺失率为16.3%，哈尔滨地区多丽波等人[22]发现oprD缺失率为26.19%，北京地区杨春等人[23]发现oprD缺失率为56.1%，这说明菌株耐药具有地域性。不同地域耐药菌株oprD缺失率不一样，本研究oprD缺失率为2.73%，与广东中山地区[21]oprD缺失率低较一致。oprD缺失率低不排除因oprD基因突变或基因表达下调导致PA对IMP耐药，于是我们进一步对107株阳性菌株进行了oprD基因测序检测和mRNA表达量检测。而国内其他大部分研究者[21-23]仅检测了oprD基因，并未对其进行测序，无法判断oprD突变情况，本研究进一步完善了此部分实验内容。本组结果提示其中有100株（90.91%）发生了有意突变，对7株（6.36%）无中断突变株进行mRNA表达量检测，发现其mRNA表达量均减少，与国内颜英俊[21]报道结果一致，同时本研究组在国内发现铜绿假单胞菌外膜蛋白oprD基因中插入IS序列，包括IS1394、ISPpu29以及ISPst2。本研究进一步证实oprD缺失，发生广泛有意突变以及mRNA表达减少是导致导致本组PA对IMP耐药的主要机制。

综上所述，IMPRPAE对常用抗菌药物耐药情况非常严峻，PA对亚胺培南耐药机制复杂，产酶、膜孔蛋白oprD基因缺失以及外排泵出机制三者有着密不可分的关联，即可单独存在，又可同时存在。临床上应该重视和加强对细菌耐药性的监测，合理地应用低耐药的抗菌药物，在一定程度上控制和避免耐亚胺培南铜绿假单胞菌的大量出现和流行爆发。