两种错义突变p.Glu502Lys和p.Gly542Ser所致遗传性Ⅻ缺陷症家系的分析

翁妙珊 林芬 章金灿 吴教仁 李邓松 谢裕强 杨立业★

在传统的凝血瀑布理论中，凝血因子Ⅻ（coagulation factorⅫ，FⅫ）是内源性凝血途径的启动因子，属于凝血接触相蛋白，主要由肝脏合成。活化的FⅫ（FⅫa）除启动内源性凝血途径外，也参与纤溶途径的激活、补体的活化和炎症反应[1]。遗传性FⅫ缺陷症（OMIM：234000）是由位于染色体5q33-qter的FⅫ基因突变所致的一种较罕见的常染色体隐性遗传病，部分家系可表现为显性遗传[2]。该病在人群中的发病率并不明确，患者在临床上通常无出血倾向，常因术前凝血常规检查显示活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）延长而被发现。随着基因检测方法的飞速发展，近年来有关FⅫ缺陷症基因突变研究的病例报道有所增加[3-4]。本文通过对1个近亲结婚的遗传性FⅫ缺陷症家系进行凝血指标检测和基因突变分析，并对突变位点的致病机制进行了初步探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象

先证者，男，30岁，广东省潮州市凤塘镇人，2017年4月以“肛瘘”为主诉入住我院治疗。检查凝血常规时发现APTT明显延长达174.8 s，遂行APTT纠正试验，确定为凝血因子缺乏，进一步筛查凝血因子活性，发现凝血因子Ⅻ活性（FⅫactivity，FⅫ：C）仅为0.8%，肝肾功能及其他凝血指标均无明显异常，考虑患者为FⅫ缺陷症。入院后行肛瘘瘘管切除术，术中和术后未见明显异常出血，术后给予抗感染、制酸、止血、消肿、高锰酸钾溶液坐浴、补液治疗，患者痊愈出院。患者自诉既往并无自发出血史和血栓史，父母为近亲结婚，其他家系成员均无出血史和血栓史。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

经本院医学伦理委员会批准，在获得先证者与家系成员的知情同意下，采集先证者与家系成员（共6人）外周血标本各2管，0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝，1管用于检测凝血指标，并于2 h内完成；另1管-80℃冻存，准备用于抽提DNA，进一步做基因检测。

1.2.2 凝血指标检测

采用美国ACL TOP700全自动血凝仪对先证者及其家系成员进行血浆凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、APTT、凝血因子Ⅷ活性（FⅧactivity，FⅧ：C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅨ activity，FⅨ：C）、凝血因子Ⅺ活性（FⅪ activity，FⅪ：C）和FⅫ：C的检测，配套试剂为美国IL公司产品。

1.2.3 基因分析方法

采用深圳亚能生物技术有限公司的试剂盒，提取基因组DNA，对先证者FⅫ基因所有的外显子及其侧翼序列进行PCR扩增，引物序列参考文献[2]，引物由上海英潍捷基公司合成。PCR产物纯化后用ABI 3700测序仪（Applied Biosystems公司，美国）进行测序，测序的结果通过网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 进行序列比较，寻找基因突变。家系成员在明确先证者基因突变位点后，PCR扩增相应区域并测序分析。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果

先证者及其妹妹APTT均明显延长，分别为174.8 s和109.5 s，FⅫ：C均极度降低，分别为0.8%和1.9%；先证者儿子APTT在正常范围，但FⅫ：C约为正常值的一半，为29.5%。先证者和家系成员其他各项凝血指标均无明显异常，凝血指标检测结果见表1。

2.2 FⅫ基因检测结果

基因测序发现先证者及其妹妹FⅫ基因均存在13号外显子c.1561G＞A杂合突变，导致p.Glu502Lys错义突变，同时在14号外显子均存在c.1681 G＞A杂合突变，导致p.Gly542Ser错义突变。家系分析表明先证者父亲及儿子为c.1561G＞A杂合突变，母亲为c.1681 G＞A杂合突变。先证者及家系成员FⅫ基因第1外显子启动子区46C/T多态性位点基因型均为CT型。基因检测结果见表2和图1。

表1 FⅫ缺陷症家系凝血指标检测结果Table 1 The coagulation indices of the hereditary coagulation factorⅫdeficiency family

表2 FⅫ缺陷症家系基因型检测结果Table 2 The genotype results of the hereditary coagulation factorⅫdeficiency family

图1 FⅫ基因突变测序结果Figure 1 The sequencing results of factorⅫgene mutation

2.3 家系图谱分析

家系分析表明，先证者及其妹妹均携带p.Glu502Lys和p.Gly542Ser2种杂合错义突变，该突变遗传自近亲结婚的父母，其中p.Glu502Lys遗传自父亲，p.Gly542Ser遗传自母亲，先证者儿子携带的p.Glu502Lys则遗传自先证者。家系图谱见图2。

3 讨论

图2 本例遗传性FⅫ缺陷症家系图Figure 2 The family tree of hereditary coagulation factorⅫdeficiency

FⅫ基因定位于人类染色体5q33-qter区，由14个外显子和13个内含子组成[5]。外显子1编码信号肽，外显子2编码一个目前还未见有同源结构的区域，外显子3和4编码与Ⅱ型纤维连接蛋白同源结构类似的区域，外显子5和7各自编码一个表皮生长因子样结构域（epidermal growth factor likedomains，EGF），外显子6编码与纤维连接蛋白的指状结构同源区。FⅫ基因的催化结构域由外显子11～14 编码[6]。成熟FⅫ是由 596个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，丝氨酸蛋白酶活性中心由His393、Asp442和 Ser544 组成[2]。

本研究中我们通过对1个近亲婚配的遗传性FⅫ缺陷症家系进行基因分析，发现先证者及其妹妹均存在c.1561G＞A（p.Glu502Lys）和c.1681 G＞A（p.Gly542Ser）2种杂合错义突变。家系成员中，先证者父亲及儿子携带p.Glu502Lys杂合突变，母亲携带p.Gly542Ser杂合突变。编码1561位于FⅫ基因13号外显子催化结构域，碱基G＞A导致p.Glu502Lys错义突变，即502位谷氨酸突变为赖氨酸，推测该突变使负电的酸性谷氨酸变成正电的碱性赖氨酸，影响了多肽链的稳定性，造成突变的蛋白质提前降解及分泌障碍，从而引起血浆中FⅫ活性的下降。邢志芳等[7]于2011年首次报道FⅫ基因p.Glu502Lys，文中2个先证者均存在p.Glu502Lys，其中1个为复合杂合子，另1个为纯合子，并通过体外表达的实验进一步证实了突变蛋白合成和分泌障碍导致FⅫ活性明显降低。此外，Jin等[8]报道其研究的FⅫ缺陷症家系中也存在FⅫ基因p.Glu502Lys。编码1681位于FⅫ基因14号外显子催化区，碱基G＞A导致p.Gly542Ser错义突变，即542位甘氨酸突变为丝氨酸，因Gly542与FⅫ基因活性位点Ser544仅有2个氨基酸的距离，p.Gly542Ser错义突变很可能会影响544位活性位点的激活，并影响其正常的生物学功能。另外，甘氨酸为非极性疏水性氨基酸，同时具有酸碱性官能团，而丝氨酸为极性亲水性氨基酸，不带电荷，电荷的改变也可能影响催化结构域蛋白质的稳定性，使其更容易被降解，引起血浆中FⅫ活性减低。已有不少学者报道过FⅫ基因p.Gly542Ser[1，9-10]，其中张扬等[10]推测该错义突变的部位处于Cys540-Cys571之间，可能影响了二硫键的断裂，从而影响FⅫ的活性。由于目前FⅫ的结构仍未完全阐明，因此对于各结构域的功能只是个推测，发生在FⅫ蛋白催化功能区的突变，在不能被充分激活的情况下可能会影响其发挥应有的生物学功能[3]。本研究中发现的2种杂合错义突变均发生在催化结构域，考虑复合杂合突变是导致先证者及其妹妹FⅫ活性极度降低的原因。

在FⅫ基因的第一外显子启动子区存在一个常见的多态性位点“46CT多态性”，具体包括46C/C、46C/T、46T/T3种基因型。46 T是会引起FⅫ翻译效率降低而导致血浆中FⅫ水平减低的多态性位点[11]。巧合的是，本例家系的先证者及其家系成员46C/T多态性位点基因型均为同一基因型，都是C/T型。

遗传性FⅫ缺陷症患者不表现自发性出血或严重的损伤后出血等其他凝血因子缺乏所具有的临床症状[12]，即使是大型的开颅手术也无明显出血症状[2]，先证者及其妹妹APTT均明显延长，FⅫ：C均极度降低，但2人均无出血和血栓形成的临床表现，先证者术中、术后也未见明显异常出血。FⅫ缺陷症与血栓性疾病间的关系多来源于散发的病例报道，两者之间的关系尚存在争议[13-14]。然而，最新的研究指出FⅫ只参与血栓形成而不参与止血过程，对于血栓形成是必需的[15]。近些年的动物实验也表明，FⅫ缺乏有可能跟FⅪ缺乏一样，是预防血栓形成的保护性因素，并且不增加出血风险，甚至也可以作为治疗血栓安全有效的靶点[16-17]。因此，从分子水平研究FⅫ缺陷症的发病机制可能将更有助于了解FⅫ与血栓形成间的相关性。