新疆西北地区原奶和手工奶酪中屎肠球菌耐药性及毒力基因分析

肖 何， 张 艳， 王永瑞， 倪永清

(新疆石河子大学 食品学院， 新疆 石河子 832000)

肠球菌属(Enterococcus)是人类及其他哺乳动物胃肠道的正常菌群之一，广泛分布于土壤、水、肉类及乳品中，其中粪肠球菌和屎肠球菌是最常见的种[1-2]。目前发现临床的尿路感染、伤口感染、心内膜炎及菌血症等[3]都与肠球菌有关，并且肠球菌能够通过染色体、质粒转移或转座子获得耐药性[4]。与粪肠球菌相比，尽管屎肠球菌引发的感染病例相对较少，但是许多研究表明屎肠球菌引起的感染非常依赖万古霉素耐药性[2]，在美国超过50%的临床屎肠球菌对氨苄西林和万古霉素耐药[5]。万古霉素抗性肠球菌(Vancomycin-resistantEnterococcus,VRE)引起的感染治疗手段有限,近二十年来已经成为最重要的临床病原菌之一[5]。此外，由于在养殖业中使用过万古霉素类似物阿伏帕星作为生长促进剂,食用动物来源的肠球菌也经常被检测到万古霉素抗性[6]。不仅如此，社区中无任何住院史的健康人群也检测到VRE，这很可能是耐药细菌通过食物链传播导致[5，7]。医疗使用的其他类抗生素如β-内酰胺类和四环素等也经常被用于畜牧养殖业中疾病预防和治疗。Zheng等[8]对中国10个省份原奶中抗生素残留的研究显示47%的样品呈阳性，此外，在养殖动物的粪便中也经常检测到耐药肠球菌[9]。显然,农畜牧业中过度使用抗生素为耐药细菌提供了一个选择性压力[10]。有研究表明来自养殖动物及动物食品(乳制品、肉类等)的耐药菌株可在人类消化道存活，并通过可移动遗传元件将耐药基因传递给人类正常肠道细菌[6]。因此，农畜牧业及有关食品中细菌的抗生素耐药性越来越受到公众的关注。新疆为多民族聚居地，畜牧业发达，原乳资源丰富，牧区牧民们在家中用传统方法将原奶手工制作成奶酪供日常食用和售卖，而奶酪的加工制作环境及牧民的个人卫生状况都会极大地影响奶酪中包括肠球菌在内的微生物种群。本研究以屎肠球菌为代表，对新疆西北地区原奶和手工奶酪中抗生素耐药性及毒力基因进行分析，评估其安全性,为近年来我国畜牧养殖业中抗生素滥用引起的耐药性扩散问题的科学评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及菌株 161份传统手工奶酪采集自牧区牧民家中，其中44份来自伊犁地区，58份来自塔城地区，47份来自阿勒泰地区，12份来自博乐地区。121份原奶采集自牧区养殖动物，其中15份来自伊犁地区，80份来自塔城地区，16份来自阿勒泰地区，10份来自博乐地区。药敏试验用质控菌株Enterococcusfaecium(CGMCC 1.2136)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基(g/L) 改良MRS培养基：葡萄糖 20，蛋白胨 10，牛肉膏10，酵母浸提物 5，柠檬酸二胺 2，磷酸氢二胺 2，乙酸钠 5，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4；肠球菌琼脂(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)(BAA)培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器 13种药敏纸片购自英国OXOID；PCR 反应相关试剂购自上海生工生物工程有限公司；扩增引物均购自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA 分子量 Maker 购自北京全式金生物技术有限公司。高速冷冻离心机Fresco21型(德国Thermo公司)； PCR仪(德国Biometra公司Tprofessional)；凝胶成像系统(法国Vilber多功能成像系统)；水平电泳仪(美国Bio-Rad公司PowerPac Universal)。

1.2 方法

1.2.1 肠球菌分离纯化 用75%的酒精擦拭手工奶酪表面，切除表面部分，取10 g剩余奶酪加入90 mL蛋白胨缓冲液，35 ℃复活1 h[11]；原奶样品取1 mL加入9 mL生理盐水[12]。样品匀浆100 μL梯度稀释后，取梯度稀释液100 μL涂布于MRS和BAA 平板上，35 ℃培养24～48 h，连续转接划线培养3次后得到单菌落。

1.2.2 菌株 DNA 的提取 采用urea-SDS-NaOH方法提取菌株DNA[13]，-20 ℃保存，进行PCR扩增。

1.2.3 屎肠球菌种、属鉴定 将革兰染色阳性、接触酶试验阴性且镜检下细胞形态为球状的细菌用Enterococcussp.引物扩增[14]，确定其为Enterococci属，以模式菌E.faeciumCGMCC 1.2136为阳性对照，再采用E.faecium种引物扩增[13]，确定到具体种(表1)。

表1 种属鉴定特异性引物

1.2.4 Rep-PCR 指纹图谱 以GTG5(5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′)为引物进行 Rep-PCR 扩增，扩增体系(25 μL)：2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L GTG5 1.5 μL，100 ng/μL DNA 模板 3 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，35个循环；65 ℃ 15 min。PCR扩增产物在 180 V (4.5 V/cm)电压下检测约100 min，电泳结束后，在紫外凝胶成像仪中观测DNA图谱并拍照，DNA带型完全一致的菌株通常认为同一物种，去除重复条带，挑选代表性菌株进行 16S rDNA基因测序分析。

1.2.5 16S rDNA基因测序及数据处理 采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增体系(25 μL)：2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 27F 0.5 μL，10 μmol/L 1492R 0.5 μL，100 ng/μL DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 次循环；72 ℃ 10 min。取 3 μL PCR 扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶进行目的片段的电泳检测。PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序所得16S rDNA序列提交GenBank数据库，用BLAST进行相关序列的搜索，与GenBank数据库中现有的近缘菌株的序列比较，序列同源性大于等于99%，则可认为菌株为该种。

1.2.6 药敏性测定 利用纸片法进行药敏性测定，药敏纸片：氨苄青霉素(AMP，10 μg)、青霉素(P，10 IU)、庆大霉素(CN，120 μg)、链霉素(S，300 μg)、万古霉素(VA，30 μg)、环丙沙星(CIP，5 μg)、四环素(TE，30 μg)、利福平(RD，5 μg)、红霉素(E，15 μg)、呋喃妥因(F，300 μg)、利奈唑胺(LZD，30 μg)、氯霉素(C，30 μg)、奎奴普丁(QD，15 μg)。结果参照CLSI标准将供试菌判读为敏感、中介和耐药三种。

1.2.7 PCR检测毒力基因 毒力基因引物序列[15]及相应退火温度见表2，进行PCR扩增。反应总体系25 μL，2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，100 ng/μL DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，合适温度1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

续表2

2 结果与分析

2.1 肠球菌分离与鉴定

经镜检、革兰染色、接触酶试验及种属特异性引物PCR扩增，从121份原奶和161份手工奶酪中共分离到90株屎肠球菌(表3)。通过Rep-PCR指纹图谱结果挑选13株代表菌株进行16S rDNA序列分析，确定其为屎肠球菌。

表3 屎肠球菌样品数、分离菌株及其来源信息

2.2 屎肠球菌对13种常见抗生素的敏感性比较

原奶及手工奶酪来源的屎肠球菌对13种抗生素的药物敏感性见表4。原奶来源的屎肠球菌仅对环丙沙星、红霉素、四环素、利奈唑胺和奎奴普丁耐药，耐药率分别为80%、15%、5%、5%和5%。手工奶酪来源肠球菌对环丙沙星的耐药率最高(84.3%)，而对氨苄青霉素、红霉素和氯霉素的耐药率最低，均为1.4%。此外，手工奶酪来源屎肠球菌对链霉素的耐药率也较高(40%)，其次是利福平(37.1%)，其他依次为四环素(8.6%)、庆大霉素(8.6%)、奎奴普丁(7.1%)、利奈唑胺(5.7%)、呋喃妥因(4.3%)、万古霉素(4.3%)和青霉素(2.9%)。

表4 原奶及手工奶酪来源屎肠球菌对13种抗生素的耐药率

续表4

2.3 屎肠球菌的耐药谱分析

原奶和手工奶酪来源的90株屎肠球菌表现出了18种耐药谱型(≥2)，在原奶和手工奶酪中分别出现了3种、17种耐药谱(表5)。奶酪来源屎肠球菌中，11株菌对2种不同的抗生素耐药，共7种耐药谱，S-CIP耐药谱较常见；26株菌对3种不同的抗生素耐药，共有7种耐药谱，S-CIP-TE耐药谱最常见；3株菌对4种不同抗生素耐药，共有2种耐药谱，S-CIP-TE-RD耐药谱较常见；1株菌对10种不同抗生素耐药，只有一种耐药谱。此外，结果显示手工奶酪来源的3株万古霉素抗性屎肠球菌，其中2株为多重耐药屎肠球菌。共有4株原奶来源的屎肠球菌对2种不同的抗生素耐药，共3种耐药谱，CIP-E耐药谱仅出现在原奶中。

表5 原奶及手工奶酪来源屎肠球菌耐药谱分析

2.4 原奶及手工奶酪来源屎肠球菌毒力基因的检测

本研究通过PCR扩增对8种毒力基因在屎肠球菌中的分布情况进行了分析(表6)。PCR结果显示手工奶酪来源的70株屎肠球菌中agg、esp、gelE 、efaAfm、cylA、cylB、cylM基因的检出率分别为31.4%、34.3%、37.1%、32.9%、30%、7.1%、8.6%。而在原奶来源的屎肠球菌中仅检测到gelE和efaAfm基因，其检出率分别为15%、65%。

表6 原奶及手工奶酪来源的屎肠球菌毒力基因的分布

3 讨 论

有报道显示，从养殖的牛、羊等动物及相关食品(如动物原奶和奶酪)也分离到了耐万古霉素肠球菌[17-18]。Gomes等[19]报道自120份食品(原奶、肉制品、奶酪)中分离了3株万古霉素抗性屎肠球菌。Nieto等[20]从手工曼彻格奶酪中分离了2株万古霉素抗性肠球菌。而本研究仅从手工奶酪中就分离到3株耐万古霉素屎肠球菌，且其中2株具多重耐药。不仅如此，其中1株具万古霉素抗性的屎肠球菌甚至对利奈唑胺耐药，而利奈唑胺是临床上治疗万古霉素抗性肠球菌感染的首选之一[5]，对其耐药会给患者的治疗增加难度。然而畜牧养殖业中很少使用万古霉素和利奈唑胺，因此很可能是由于手工奶酪的制作工艺及加工环境，导致其受到来自原材料之外的污染，但其具体来源有待进一步研究。

本研究在原奶和奶酪中均检测到对临床治疗使用较为有效的抗生素，如红霉素、四环素、诺酮类抗生素环丙沙星等具耐药性的屎肠球菌。其中对诺酮类抗生素环丙沙星的耐药率最高，这与Hammad等[11]和 Gaglio等[21]报道的乳品来源肠球菌对环丙沙星的耐药率不一致。不仅如此，原奶和手工奶酪中的屎肠球菌均对多种抗生素具耐药性，且多重耐药性在手工奶酪来源屎肠球菌中更为普遍。畜牧养殖业中出于对传染性疾病的预防和治疗疾病的需要会大量喂食抗生素，从而经常从养殖动物及相关食品中分离到多重耐药肠球菌[10，22]，如Qi等[23]就从新疆养殖的马中分离到多重耐药肠球菌。有研究表明动物性食品如乳制品、肉类等是耐药细菌传播的一个中间体，可通过食物链将栖息的耐药菌株传播给人类[6，21]，因此动物源性食品中的抗生素耐药性问题应该引起人们的关注和重视。此外，加强畜牧业中抗生素使用的监督，同时加大科学用药的宣传，不可盲目长期大量用药，避免高耐药、多重耐药菌株出现和传播也很有必要。

本研究的毒力检测结果表明毒力因子在手工奶酪中分布较广，而肠球菌要引起感染，必须携带毒力因子帮助其定殖宿主组织并逃避宿主免疫防御机制[11，24]。这进一步说明手工奶酪对消费者具安全隐患，很可能手工奶酪在加工过程中受到污染或者交叉污染所致。因此，应当加强牧区安全卫生宣传，提倡放牧区与生活区域隔离，同时加强对市售手工奶酪中耐药肠球菌的检测，防止其进入食物链进行传播。