土壤中钾细菌的筛选及筛选底物加入量对其数量的影响

郭玲玲， 吴红艳， 宗玉丽， 徐 冲， 柴林山， 张疏雨

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

钾细菌又称硅酸盐细菌(Silicate bacteria)，主要指胶质芽胞杆菌等几种特殊的细菌[1]，是一类细菌的总称，包括胶质芽胞杆菌 (Bacillusmucilaginosus)、土壤芽胞杆菌(B.edaphicus)和环状芽胞杆菌(B.circulans)，能够分解土壤中的不溶性硅酸盐矿物，释放其中的硅、磷、钾等元素，起到增加土壤肥力的作用[2-3]，农业上用作生物肥料，可以全部或部分替代化肥，而且因为是活细菌，作用时间长，可持续提供磷、钾元素[4-5]。然而我国大多数土壤中全钾和有效钾含量较低。土壤学家认为，有至少三分之一的土壤是缺钾的，而且增施氮肥后，较高的作物产量加速了其他养分的消耗，加重了由土壤有效钾含量低所引起的作物生产问题[6]。对于钾细菌的研究，自1950年前苏联学者亚历山大罗夫从土壤中分离得到具有释放铝硅酸盐矿物中钾元素能力的硅酸盐细菌后，王伟等[7]从河北地区的玉米田土壤中分离得到具有分解硅酸盐类矿物能力的胶质芽胞杆菌h-3菌株，盛下放[8]分离筛选到具有高效解钾活性的硅酸盐细菌NBT菌株，这些菌株解钾效率都明显增加。虽然有效钾含量较少, 但我国拥有丰富的、以钾长石为主的难溶性硅铝酸钾矿产资源[9-10]。因此有效地开发钾长石资源是解决农业生产中可溶性钾匮乏问题的重要方法和途径,目前利用钾长石粉作为筛选底物筛选钾细菌的方法研究较少。本研究旨在研究盆栽番茄土壤中加入不同数量的钾长石粉后其解钾细菌数量的变化，同时对土壤中的钾细菌进行初步筛选，为进一步研究土壤中解钾细菌的分离、纯化及其鉴定提供参考，也为钾细菌在农业生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 植物品名为番茄中蔬四号(购自市场)，钾细菌K01(购自中科院微生物所菌种保藏中心)，钾细菌K02(本研究室自行筛选，生产用菌株)。

1.1.2 培养基 ①液体富集培养基：蔗糖10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42.0 g，CaCO30.1 g，FeCl30.05 g，钾长石粉1.0 g，水1 000 mL。②固体初筛培养基：蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42 g，CaCO30.1 g，FeCl30.05 g，钾长石粉1.0 g，琼脂 18 g，水1 000 mL。③解钾细菌培养基：甘露醇10 g，酵母膏0.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，CaCO331.0 g，MgCl20.2 g，水1 000 mL。

1.1.3 试剂 钾长石粉(泰州市长浦化学试剂有限公司)；四苯硼钠、硝酸钠、EDTA、硼砂、甲醛、氯化钾均为分析纯。

1.1.4 仪器与设备 SPX-450生化培养箱(中仪国科科技有限公司)，HZQ-Q全温振荡器(东联电子技术开发有限公司)，T6新悦-723分光光度计，低温冷冻高速离心机(SIGMA)。

1.2 方法

1.2.1 土壤处理及移栽 ①钾长石粉的处理：钾长石粉过180目，用去离子水浸泡过夜，然后用去离子水反复冲洗，去除其中的可溶性钾，阴干，备用。②土壤处理及番茄秧苗的移栽：在土壤中加入不同数量的钾长石粉，各处理组质量分数分别为0、0.1%、0.2%、0.4%，对应编号为1、2、3、4。将培养钵中的幼苗移栽至含有不同浓度钾长石粉土壤的小花盆中，定期定量浇水。

1.2.2 样品取得及菌株筛选 ①取样方法：将花盆内去除秧苗地上部分的土壤及根际所附着的土壤混合均匀，即为土壤样品。在1个植株生长过程中定期取样，即每15～20 d取样1次。②菌株筛选：取混合均匀的土壤样品5 g于液体富集培养基中，30 ℃摇床培养72 h，取培养液进行梯度稀释，涂布于固体初筛培养基上，30 ℃ 恒温培养48 h，计数。观察菌落的形状、边缘整齐度，是否凸起，是否有弹性等特征，挑取有效菌株并保存。

1.2.3 菌株解钾能力测试(以速效钾含量计) 采用四苯硼钠比浊法[11]进行测定。①原理：样品中的K+在微碱性介质中与四苯硼钠反应，生成溶解度很小的微小颗粒四苯硼钾白色沉淀，用分光光度计检测其浊性，从而得到样品中可溶性钾的含量。②钾标准曲线制作：按不同浓度吸取氯化钾标准溶液8 mL，加入甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀，再加入3%四苯硼钠溶液，立即摇匀，室温放置30 min，分光光度计在420 nm处测吸光度值(A)，以吸光度值为纵坐标、四苯硼钠浓度为横坐标绘制标准曲线，求得回归方程。③样品测试：将筛选的有效菌株及对照菌株K01、K02分别接种于解钾能力测试培养基中，30 ℃、150 r/min摇床培养48 h，将培养液8 000 r/min 离心20 min，上清液作为供试液，按照标准曲线制备方法进行测试。

2 结果与分析

2.1 番茄不同生长时间不同钾长石粉加入量钾细菌菌数测试

从图1可以看出，在番茄整个生长过程中，不同取样时间土壤样品中钾长石粉加入量为0.2%时钾细菌数量最多，其次为0.1%，再次为0.4%，三种处理的钾细菌数量均多于空白对照，由多至少的顺序为0.2%>0.1%>0.4%>空白对照。

图1 番茄不同生长时间不同钾长石粉加入量钾细菌菌数测试Fig.1 Tested results of PDB amount after adding different amount of feldspar powder on the growing times of tomato

2.2 番茄生长过程中钾细菌菌落形态观察

图2 番茄生长过程中钾细菌菌落形态观察Fig.2 Observation results of potassium bacteria colony morphology during the growth of tomato

番茄生长过程中钾细菌菌落形态见图2。挑取呈圆形、边缘整齐、表面湿润、菌落黏稠、呈玻璃珠状、透明、凸出、有勃稠感、有弹性的菌落，进一步纯化，选取长势较好的菌株保藏，用于进一步研究。

2.3 菌株解钾能力测试

2.3.1 标准曲线制备 菌株解钾能力测试标准曲线(四苯硼钠法)及回归方程见图3。

图3 标准曲线制备Fig.3 Preparation results of standard curve

2.3.2 钾细菌菌株解钾能力测试 钾细菌菌株解钾能力测试结果见图4。结果表明，筛选菌株的解钾效率高于K01的共14株，高于K02的共9株。其中解钾效率最高的菌株为5.15-2，解钾效率达35.4%，较外购生产菌种K01高13倍，较本实验室保存菌种K02高3.6倍。

图4 钾细菌菌株解钾能力测试Fig.4 Observation results of potassium bacteria colony morphology during the growth of tomato

3 讨 论

本研究结果表明，不同钾长石粉加入量对土壤中钾细菌数量具有一定的影响，随着加入量的增加，钾细菌数量也增加，但增加到一定比例时反而会抑制菌群的生长，数量会相对减少，但是仍然会高于未加入钾长石粉的土壤钾细菌数量。同时，在植株生长过程中，适合地筛选底物浓度能促进植株生长，长势明显好于空白对照，而且座果率也高于空白对照。基于解钾菌研究现状，今后在筛选获得高效解钾菌株的基础上，应通过诱变育种或采用基因工程技术等手段改良菌株[12]。同时，在钾肥中加入适当的如钾长石粉之类的筛选底物，进一步提高菌种的生长能力和解钾活力，使其在微生物浸矿和微生物肥料等方面得到广泛应用。