特基拉芽胞杆菌B05高密度发酵培养基与发酵条件优化

张翠绵， 兰泽君， 彭杰丽， 胡 栋， 魏晓燕， 贾 楠， 黄晓东， 王占武*

(1. 河北省农林科学院遗传生理研究所 河北省植物转基因中心重点实验室，河北 石家庄 050051; 2. 南京农业大学，江苏 南京 210014)

我国有盐碱地9 913万hm2，其中环渤海70万hm2，是重要的潜在耕地资源[1]，实施改良利用是提高粮食产能、改善区域生态环境、提高农民收入的重要途经。世界各国都在努力寻找盐碱地改良的科学方法，目前可应用的方法有：①以水压盐种植水稻[2-4]，该方法当年可见效，但仅限于水源丰富的地区；②采用耕作措施，切断土壤毛细管，控制水分毛细管运动，阻止盐分向地表运动[4-5]，但仅限于作物生长前使用；③土壤改良剂，目前主要利用有机或无机材料，如草炭、腐殖酸、脱硫烟灰等中和或吸附作用改良盐碱耕地[6-7]，但材料用量大，成本高，也受地方资源的限制；④微生物改良方法，根际接种功能微生物，提高植物耐盐性，目前研究和应用较多的是菌根菌[8]，由于菌根菌的人工繁殖难度较大，限制了规模应用，因而菌剂生产性能优良的根际细菌的利用受到世界各国学者的关注[9-10]。本研究采用植物与微生物联合改良盐碱地思路，从盐碱低产田小麦根际筛选获得了1株与冬小麦具有良好融合关系的特基拉芽胞杆菌B05，在海兴县中低产田小麦上应用，可显著提高小麦的耐盐和耐旱能力，产量提高7%～9%(另文发表)，具有广阔应用潜力。特基拉芽胞杆菌具有抗菌、促生的作用已有报道[11-13]，但应用于盐碱土壤改良尚属首次。前期研究发现，菌株B05的扩繁能力较弱，采用常规细菌培养基，活菌浓度在108cfu/mL水平上。为促进该菌的转化应用，本研究进行高密度发酵条件的研究，同时在10 L发酵罐水平上进行试验，以达到预期效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 特基拉芽胞杆菌(Bacillustequilensis)B05菌株，由河北省农林科学院遗传生理研究所分离并保存。

1.1.2 培养基 NA 固体培养基(质量分数，%)：牛肉浸膏0.3，蛋白胨1 ，葡萄糖0.25，琼脂1.8，调pH 值为7.2。121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，用于B05菌株活化和培养；NB液体培养基组分：不加琼脂的NA培养基，用于B05菌株种子液培养。

1.1.3 仪器与设备 全温振荡培养箱(哈尔滨市中联，HZQ-F160)；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器(上海博讯，YXQ-SG46-280S)；电子天平(北京赛多利斯，FC104)；pH计(上海盛磁，PHS-25)；生化培养箱(上海博讯，SPX-250B-Z)；超净工作台(上海博讯，SW-CJ-1F)。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 将保存于斜面培养基上的特基拉芽胞杆菌B05活化，37 ℃培养24 h，于 4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 种子液制备 将50 mL NB培养液置于250 mL锥形瓶中，灭菌，接入1环活化后的B05菌种，37 ℃、180 r/min，培养24 h。

1.2.3 摇瓶发酵培养 取50 mL发酵培养基于250 mL锥形瓶中，灭菌后接入1 mL B05芽胞杆菌种子液，37 ℃、180 r/min培养24 h。

1.2.4 总活菌量和芽胞量测定 采用平板计数法[14]测总活菌量。芽胞量测定：将发酵液于80 ℃水浴中保持10 min，再用检测活菌方法测定。以活菌总量作为培养基优化评判标准。

1.2.5 发酵培养基的优化 ①碳源的筛选优化：分别以甘油、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖和玉米淀粉相等质量替代NB培养基中的碳源，其他成分不变[15-16]。在装有100 mL(250 mL三角瓶中)NB培养液的三角瓶中，接3%种子液，放于恒温(37 ℃)摇床(180 r/min)培养24 h，取样测定发酵液活菌数和芽胞数，每处理重复3次，确定最佳碳源。②氮源的筛选优化：以①中筛选的碳源为基础，分别以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、麸皮、KNO3和(NH4)2SO4相等质量替代NB培养基中的氮源，其他同上，每处理重复3次，确定最佳氮源。③无机盐的筛选：在上述筛选的碳源和氮源的基础上，分别添加0.5%的FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、KH2PO4、K2HPO4+KH2PO4、K2HPO4+KH2PO4+MnSO4·H2O和NaCl，其他条件同上，每处理重复3次，确定最佳无机盐种类或组合。

1.2.6 多因素正交试验 以上述实验筛选出的最佳碳、氮、无机盐为变异因子，采用L9(34)正交表，进行优化试验，确定各组分最佳配比[17]。

1.2.7 菌株B05发酵条件优化 以上述优化的各因素及配比确定发酵培养基[18-19]，以测定发酵液活菌数为依据,对温度(A)、初始pH值(B)、转速(C)、接种量(D)和装液量(E)5个因素进行L16(45)正交试验,确定最佳发酵条件。

1.2.8 发酵罐(10 L)扩大培养 釆用液体发酵罐(10 L)，配培养液7 L,液体种子培养及接种量均同摇瓶试验。发酵条件：通气量400 L/h，转速180 r/min，发酵温度35 ℃，发酵过程的溶氧控制在20%以上，罐压保持在0.03～0.05 MPa,初始pH为7.0。每2 h取样，测活菌数，绘制生长曲线。

1.2.9 活菌发酵液对小麦(小偃60)苗的影响 取含盐0.4 %的盐碱地土壤装入塑料盆中，试验设空白对照(以蒸馏水代替菌剂)、阳性对照(以灭菌液体培养基代替菌剂)、发酵菌液3个处理。挑选萌发整齐一致的小麦种子栽入盆中，每盆4棵，每处理重复6次，置于大棚温室内，第一次利用称重法浇水或菌剂(菌剂浓度为2×108cfu/mL)，之后用称重法浇水，其他管理措施一致。培养30 d，测定小麦根长和株高，将小麦根、茎105 ℃杀青30 min，80 ℃烘至恒重，称茎干重和根干重。

1.2.10 数据统计与分析 处理间差异显著性(F=MSA/MSe)分析用F检验法进行；用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对菌株B05液体发酵的影响

由图1可知，不同碳源对菌株B05活菌量均有一定影响，以麦芽浸粉为碳源的发酵液活菌量和芽胞数最大，分别为7.5×108cfu/mL和5.5×108cfu/mL，其次为可溶性淀粉和玉米淀粉，其他碳源发酵水平较低。因此选用麦芽浸粉作为培养基碳源。

图1 不同碳源对菌株B05发酵的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.2 不同氮源对菌株B05液体发酵水平的影响

图2结果表明，使用酵母浸粉菌株B05的活菌量和芽胞数最多，分别为7.43×108和5.8×108cfu/mL，其次为蛋白胨和胰蛋白胨，且两者间无显著性差异，并且两者的芽胞数较其对应的活菌数较高，其他无机氮源发酵水平较低。因此从营养成分的互补和节约成本考虑，选用胰蛋白胨、酵母浸粉作为培养基氮源。

图2 不同氮源对菌株B05发酵的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.3 不同无机盐对菌株B05发酵水平的影响

由图3可知，以麦芽浸粉为碳源，酵母浸粉、胰蛋白胨为氮源，不同无机盐对菌株B05活菌数的影响不同。添加MnSO4·H2O的组别，其活菌数和芽胞数分别为5.5×108和4.4×108cfu/mL，芽胞生成率最高；添加复合盐(质量比)KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1的组别，活菌数和芽胞数显著高于其他无机盐类，分别为1.1×109cfu/mL和8.1×108cfu/mL，其余组别较低。可见KH2PO4与K2HPO4两者利于细胞生长，MnSO4·H2O对芽胞形成有促进作用。因此选择KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1作为培养液的无机盐(图3)。

图3 不同无机盐对菌株B05发酵的影响Fig.3 Effects of different inorganic elements on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.4 培养基配比的优化

通过上述碳源、氮源以及无机盐单因素试验的研究，确定了B05菌株液体发酵的最佳组分，为进一步优化发酵培养基配方，选用4因素3水平的L9(34)正交表设计，以活菌数为标准，确定各组分的最佳配比。其因素和水平见表1。试验结果(表2)表明，不同组分对菌株B05发酵影响程度为N>S>P>M，最佳组合为M2N2P3S1，活菌数最高达6.03×109cfu/mL，因此，菌株B05发酵的最佳培养基配方(质量分数，%)：麦芽浸粉1，酵母浸粉2，胰蛋白胨2，无机盐0.3(质量比：KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1)。

表1 B05菌株正交试验因素与水平

表2 正交试验结果

注：上标字母为邓肯式新复极差测验结果(小写字母α=0.05，大写字母α=0.01)，表4、6同

2.5 菌株B05液体发酵工艺优化

2.5.1 液体种子的制备 将菌株B05接种于50 mL NB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h。

2.5.2 发酵条件的优化 以菌液活菌数为依据，选择温度(A)、pH(B)、转速(C)、接种量(D)和装液量(E)5个因素对菌株B05进行L16(45)正交试验(表3)，从而确定菌株最优发酵条件。优化结果见表4。由表4可以看出，根据正交试验结果进行极差分析可知，各因素对菌体生长影响主次顺序为A>D>E>B>C，即温度和接种量对菌株B05生长的影响较大，pH和装液量的影响次之，转速的影响最小，通过正交试验，得到最佳组合为A2B1C3D4E2，通过正交表分析，得到理论最佳组合为A2B1C2D4E3。因此，需将两组合进行二次平行试验。

表3 L16(45)正交试验设计表

2.5.3 摇瓶验证试验 将需验证的两组合进行摇床培养18 h，结果见表5。由表5可见，组合A2B1C3D4E2活菌数和芽胞数分别为9.3×1010和8.1×1010cfu/mL，正交试验中产量最高的组合A2B1C2D4E3活菌数和芽胞数分别为6.8×1010和5.7×1010cfu/mL，组合A2B1C3D4E2比A2B1C2D4E3菌液活菌数和芽胞数分别提高了26.9%和29.6%。因此本研究培养菌株B05最优条件为温度30 ℃、pH 6.5、转速200 r/min、接种量7%、装液量40%。

表5 理论组合的试验结果

2.6 最佳条件下菌株B05的生长曲线

采用上述优化的培养基配方进行摇瓶培养：将菌株B05以7%接种量接入摇瓶，30 ℃、200 r/min、装液量40%、初始pH 6.5进行发酵培养。从接种的0 h开始，每隔2 h取菌液进行活菌数测定，平行操作3次，以活菌数为纵坐标，发酵时间为横坐标，以活菌数的平均值绘制菌体生长曲线。从图4可见，该菌株培养0～4 h为迟缓期，4～10 h为对数期，10～18 h为稳定期，18 h后随着培养时间的延长，营养物质消耗和代谢产物的大量积累，菌株进入衰退期。因此，要得到发酵液较高的活菌量可在18 h时终止培养。

图4 菌株B05的生长曲线Fig.4 Growth curve of strain B05

2.7 发酵罐(10 L)扩大培养

以摇瓶发酵为基础，进行液体发酵罐(10 L)的扩大培养，发酵2 h开始第一次取样，每隔2 h取发酵液，测定菌株B05活菌数。从图5可以看出，0～8 h菌体活菌数少，8～10 h活菌数迅速增多，达到最大值；10～18 h活菌数稳定在7.5×1010cfu/mL左右，18 h后活菌数渐少，菌体衰老加速，进入衰亡期。发酵罐(10 L)扩大培养与摇瓶发酵时间两者基本一致。

2.8 发酵液对小麦耐盐性的影响

以含盐0.4%的盐碱土壤为基质，进行了小麦盆栽试验。从表6可见，菌株B05发酵液处理的小麦根长、株高、茎干重和根干重均显著提高(P<0.05)，全株生物量提高45.8%，说明菌株B05可显著提高小麦植株的耐盐性。

图5 发酵罐(10 L)发酵过程曲线Fig.5 The fermentation process curve in fermentation tank(10 L)

处理株高/cm根长/cm根干重/mg茎干重/mg空白对照18.4cC13.2cC0.04cC0.20cC阳性对照20.3bB14.6bB0.05bB0.25bB发酵型菌剂22.4aA15.5aA0.06aA0.29aA

3 讨 论

采用单一因素筛选试验，明确麦芽浸粉、酵母浸粉、胰蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4和MnSO4·H2O对菌株B05扩繁具有较大影响。以上述物质为基础成分，利用正交试验，优化培养基配方(质量分数，%)：麦芽浸粉1、酵母浸粉2、胰蛋白胨2和复合无机盐0.3(质量比：KH2PO4∶ K2HPO4∶ MnSO4·H2O =1∶ 1∶ 1)。由于在发酵过程中，高密度菌剂浓度除与菌种本身特性和培养基所含碳源、氮源、无机盐种类及配比有关外，还与发酵工艺参数有关[20]，因此本研究采用L16( 45)正交试验，优化了发酵温度、pH、转速、接种量和装液量等发酵条件对发酵水平的影响，确定最佳发酵条件为温度30 ℃、pH 6.5、转速200 r/min、接种量7%、装液量40%，培养18 h，菌液活菌数达到9.3×1010cfu/mL，比优化前活菌数提高了两个数量级，发酵时间缩短2 h，降低能耗和生产成本明显。可见，对培养基和发酵条件的双重优化可较大幅度提高目的菌株的发酵水平。周映华等[21]通过对1株枯草芽胞杆菌发酵条件在三角瓶中进行优化，发酵液中菌数最终达到1.26×109cfu/mL。

在10 L全自动液体发酵罐水平上进行了扩大培养试验，发现菌体生长曲线基本与摇瓶条件下一致，在18 h时处于稳定期末期，芽胞生成率较高，适于菌体收获。在实际生产中可以缩短生产周期、降低能耗，提高生产效率。在含盐0.4%盐碱土壤上进行了小麦盆栽试验，发酵菌液可显著提高小麦的耐盐性，全株生物量提高45.8%，应用效果显著。本研究获得的最佳参数具有用于规模发酵的可能性，下一步将进一步扩大发酵规模，为工业化生产提供技术参数。