白芨水煎剂对结肠黑变病模型豚鼠结肠上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

张兆林 陈冻伢 徐 虹 徐建军 冯 慧 陈建永

结肠黑变病（Melanosis coli，MC）指结肠黏膜固有层内巨噬细胞含脂褐素（Lipofuscin）或黑色素（Melanin）的一种黏膜色素沉着性病变。MC多见于长期便秘以及服用蒽醌类（Anthraquinone）药物的患者[1]。大剂量连续服用1～4个月，即可见一定程度MC的发生。MC患者结肠黏膜出现增生性病变的机会大大增加，其中结肠癌和结肠腺瘤性息肉的发生率高，少数患者还可出现假性肠狭窄[2]。目前普遍认为MC与结肠上皮细胞凋亡存在一定的相关性。肿瘤细胞坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）能够诱导细胞凋亡。B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）在细胞凋亡中起着关键作用，是一对具有拮抗作用的基因。药理研究证实，白芨水煎剂灌服能保护大鼠胃黏膜，抑制溃疡发生；还能促进表皮损伤的愈合，促进基底膜修复[3]。本研究通过大黄提取液灌胃制备MC模型豚鼠，并予10%白芨水煎剂灌肠，通过检测肠黏膜上皮细胞的凋亡以及TNFα、Bcl-2和Bax表达，探讨白芨水煎剂对蒽醌类药物所致MC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物 健康豚鼠40只，雌雄各半，体质量（400g±20）g，清洁级，由浙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SYXK（浙）2013-0184。采用架式笼养喂养，每笼4只，雌雄分笼喂养。普通饲料，自由饮水，室温保持在20℃左右，相对湿度40～60%，光照周期12h。

1.2 药 物 实验药物大黄、白芨均购自浙江省医药公司，生产单位杭州桐君堂中药饮片厂，批号20150713。大黄提取工艺：大黄饮片机械粉碎成70mm粗粉，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5h。提取液合并过滤，60℃减压浓缩，制成大黄提取液（每1mL相当于生药3g），置4℃冰箱保存。10%白芨水煎剂制备工艺：白芨干燥，粉碎，水提取前冷浸30min，加入10倍蒸馏水煎煮2次，共煎煮2h。无菌4层纱布过滤杂质，合并滤液浓缩，制成白芨水煎剂（每1mL相当于生药0.1g），置4℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂 原位细胞凋亡荧光检测试剂盒购自德国Roche公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术公司；抗TNFα小鼠单克隆抗体购自美国Abcam公司；抗Bcl-2兔多克隆抗体、抗Bax兔多克隆抗体、抗GAPDh小鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.4 MC豚鼠模型制备 将40只豚鼠适应性喂养7d后，采用随机数字表法分为三组，正常组8只，模型组16只，白芨水煎剂组16只。模型组及白芨组均予大黄提取液6g·kg-1·d-1连续灌胃60天，造模第3周模型组开始予生理盐水灌肠，白芨组予10%白芨水煎剂灌肠，每周3次，灌肠方法如下，将8F导尿管涂抹凡士林后从肛门轻轻插入5cm，推入2mL药液并捏紧肛门倒放5min。造模结束后，各组豚鼠予25%乌拉坦按0.7mL/100g腹腔麻醉处死。处死前豚鼠均禁食、禁水24h。处死后立刻剖取盲肠及全部结肠，取适量结肠标本，用4℃生理盐水反复清洗肠腔内容物，置于10%中性甲醛液及液氮中保存备用。

1.5 结肠组织苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和黑色素染色 取10%中性甲醛液固定组织，石蜡包埋切片，切片厚度3～5μm，常规HE染色后光学显微镜下观察。取石蜡包埋的组织，切片厚度3～5μm，脱蜡洗涤后投入M.F.溶液中，置于暗室12h，投入5%硫代硫酸钠2min，用中性红复染后脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。

1.6 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色 操作步骤根据Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein说明书进行：烤片2～3h脱蜡后二甲苯浸洗，依次用梯度乙醇浸洗，0.01M PBS冲洗后抗原修复，滴加封闭用正常山羊血清室温孵育30min，滴加50μL TUNEL反应液37℃避光孵育60min，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，激发光波长450～500nm，检测波长515-565nm（绿色），计数凋亡细胞。

1.7 免疫印迹 取各组离体的豚鼠结肠加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每组取50μg样品蛋白，进行12%SDS-PAGE电泳。将胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，以含5%脱脂奶粉的TTBS 液 （0.121%Tris，0.9%NaCl，0.1%Tween-20，ph7.5）室温封闭1h。加入抗TNFα小鼠单克隆抗体（1:1000），抗 Bcl-2兔多克隆抗体（1:500）或抗 Bax兔多克隆抗体（1:500）4℃孵育过夜，TTBS洗膜3次，除去未结合的一抗，然后相应加入hRP藕联兔抗小鼠IgG或hRP藕联山羊抗兔IgG，室温孵育1h。TTBS洗膜3次后进行ECL显影曝光。

1.8 统计学方法 应用SPSS20.0软件包对数据进行统计处理。数据资料用均数±标准差（x±s） 表示。多组样本均数比较采用单因素方差分析，用LSD Post hoc Tests检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠黏膜黑变病评分 肉眼观察正常组豚鼠结肠呈浅红色，未见明显色素沉着。模型组及白芨组豚鼠结肠则有不同程度的黑变出现。以盲肠与近端结肠最为显著，其余小肠等组织未见黑变。病变结肠黏膜尚光滑，反光较差，弹性降低，表面呈浅褐色或深褐色，与正常肠黏膜分界不清。白芨组豚鼠结肠黏膜颜色较模型组浅，黑变组织面积少（见插页图1）。

图1 各组豚鼠结肠黏膜

图2 结肠组织hE和黑色素染色（×200） （A）hE染色；（B）黑色素染色

图3 豚鼠结肠组织TNFα蛋白表达

图4 豚鼠结肠组织Bcl-2和Bax蛋白表达

用10%中性甲醛液固定的组织标本黏膜层朝上，平铺在白色硬纸板上，大头针固定，用放大镜观察肠黏膜标本的黑变程度并评分。评分标准[4]：无黑变0分，盲肠1分，盲肠和部分近段结肠2分，全结肠3分；颜色：浅红色0分，浅褐色1分，暗褐色2分，深褐色3分。模型组结肠黏膜与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），白芨组结肠黏膜与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组豚鼠结肠黏膜黑变病评分（分，x±s）

2.2 hE染色和黑色素染色 HE染色结果显示，正常组豚鼠的结肠黏膜结构完整，腺体及隐窝清晰可见，黏膜固有层及黏膜下层未见炎细胞浸润，固有层内未见含有棕褐色颗粒的巨噬细胞。模型组则见结肠黏膜上皮细胞大量脱落，固有层及黏膜下层可见明显中性粒细胞浸润，隐窝及腺体减少，结构紊乱，黏膜肌层与固有层间见较多棕褐色色素颗粒沉着。白芨组结肠黏膜上皮细胞少量脱落，固有层及黏膜下层可见少量中性粒细胞侵润，固有层散在分布棕黄褐色色素颗粒（插页图2A）。黑色素染色如插页图2B所示，模型组及白芨组豚鼠的结肠黏膜呈现不同程度的阳染色素颗粒，且白芨组阳性程度较模型组轻微，正常组未见黑色素阳染区域。

2.3 各组豚鼠结肠黏膜上皮细胞凋亡检测 采用TUNEL（FITC荧光法）对肠黏膜上皮细胞凋亡进行检测，并使用Image-pro PLUS 5.1版图像分析软件，每个样本随机选取5个高倍视野，计数1，000个细胞采用灰度值120～145，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，对结肠上皮细胞凋亡的表达率进行定量分析。结果显示，与正常组相比较，模型组豚鼠结肠黏膜上皮细胞凋亡阳性率显著增高（P＜0.01），白芨组豚鼠结肠黏膜上皮细胞凋亡阳性率比模型组显著下降（P＜0.01），见表 2。

表2 各组TUNNEL染色阳性率比较（%，x±s）

2.4 各组豚鼠结肠组织TNFα表达 与正常组比较，模型组豚鼠结肠组织TNFα蛋白表达量显著增高，为正常组的 4.27倍（P＜0.01）。白芨组豚鼠结肠TNFα表达量较模型组显著下降，为模型组的54.6%（P＜0.01），见表 3，插页图 3。

表3 各组豚鼠结肠组织TNFα表达水平比较（x±s）

2.5 各组豚鼠结肠组织Bcl-2和Bax表达 与正常组比较，模型组豚鼠结肠组织Bcl-2蛋白表达量显著增加，为正常组的3.68倍（P＜0.01）。白芨组的Bcl-2表达为模型组的 47.8%（P＜0.01）。相反，模型组豚鼠结肠组织Bax的表达量与正常组相比显著下降，为正常组的45.0%（P＜0.01）。白芨组Bax表达比模型组显著增高，为模型组的 1.96 倍（P＜0.01）。见表 4，插页图4。

3 讨论

目前普遍认为蒽醌类泻药如美鼠李皮、番泻叶、大黄等为主的蒽醌类泻药长期服用为MC发生的主要因素[5]。刘中辉等[6]在回顾性研究350例完成结肠镜检查的患者中，结肠黑变病组结肠息肉发现率达40.8%，远高于非结肠黑变病的23.0%，认为MC患者结肠息肉发生率高。此外，有研究发现MC与结肠癌存在一定的关系[7]。

表4 各组豚鼠结肠组织Bcl-2和Bax表达水平比较（x±s）

Byers等[8]指出，结肠上皮凋亡数目与MC严重程度呈正相关。Chiu等[9]研究认为，大黄素等游离蒽醌可通过Bax与Fas信号转导途径诱导肿瘤细胞发生凋亡。Britta等[10]发现，长期服用泻药患者的结肠黏膜Bcl-2表达增加。长期服用蒽醌类泻药可使肠黏膜上皮细胞损伤、凋亡，产生的凋亡小体透过基底膜小孔转移至黏膜固有层。此类物质在巨噬细胞中形成次级溶酶体的过程中，因溶酶体过载，导致细胞分解代谢障碍，最终持续形成大量脂褐素或黑色素。随着长期应用蒽醌类泻药，最终形成典型的MC[11]。TNFα可以增加白细胞以及血管壁的黏附性，以致微血管迟发性低灌注，对毛细血管有直接的毒性作用，且能诱导敏感细胞发生坏死和凋亡[12]。在细胞的凋亡调控过程中，各种基因之间存在着相互作用，其中Bcl-2和Bax被认为在其中起着关键作用。在正常结肠组织Bcl-2表达较弱，而从腺瘤到腺癌进展过程中，Bcl-2表达明显增强[13]。Bax存在于Bcl-2家族中，是促进凋亡的相关蛋白。Bcl-2/Bax比值决定细胞凋亡的发生与否，对凋亡的发生过程起着重要的调控作用[14]。

曾颂[3]研究指出，白芨水煎剂灌服能够保护大鼠胃黏膜，抑制溃疡发生，这可能与刺激胃黏膜合成与释放内源性前列腺素（Prostaglandin，PG）有关。白芨还可以促进表皮损伤的愈合，加快基底膜修复。电镜下对二甲氨基偶氮苯（Dimethylaminoazobellzane，DAB）诱导的大鼠肝癌细胞核增大，核膜弯曲凹陷，而予白芨注射液的肝细胞形态与正常肝细胞形态相近[15]。

本研究结果表明，白芨水煎剂可能通过抑制MC豚鼠结肠组织TNFα和Bcl-2蛋白表达，增加Bax表达，降低Bcl-2/Bax比值，抑制结肠上皮细胞凋亡，从而改善MC。