黑木耳黑色素F1 的结构初探

冯 磊

（黑龙江省林业科学院，黑龙江 哈尔滨 150081）

黑色素存在于植物、动物和微生物中，由于其广泛来源及特殊的生物学意义，黑色素正被广泛研究。已有研究显示，黑色素具有降低紫外线辐射伤害、清除体内自由基、抗病毒和免疫调节等功能[1-3]。本研究利用先前分离的黑木耳黑色素，借助显微技术和化学波谱技术对黑木耳黑色素F1的微观结构、官能团构成以及元素组成等结构信息进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑木耳黑色素F1为前期实验分离纯化得到。

1.2 黑木耳黑色素F1 的紫外-可见光谱扫描

称取少量的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素分别溶于pH 为8 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中，在40 ℃的条件下，在可控温磁力搅拌器中搅拌溶解1 h，使色素尽可能的溶解，溶液经4 000 r/min 离心1 min，取上清液在波长200～600 nm 范围内进行紫外-可见光谱扫描。

1.3 黑木耳黑色素F1 的扫描电子显微镜

称取少量的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素喷涂Au 后，通过环境扫描电子显微镜直接成像，观察黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素的微观结构。

1.4 黑木耳黑色素F1 的傅里叶红外变换光谱扫描

采用溴化钾压片法，按黑木耳黑色素F1或黑木耳黑色素分别与溴化钾1∶200 的比例进行配比，研成细粉后进行压片。在500～4000 cm-1范围内测定其红外吸收光谱。

1.5 黑木耳黑色素F1 的核磁共振扫描

将冷冻干燥的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素分别溶解在DMSO-d6中。1H NMR 的试验条件为：温度为299.0 K，保留时间1.000 s，观测频谱宽度8 223.685 Hz，16 个重复样品，观测频率400.10 MHz。13C NMR 的试验条件为：4 mm 的HR MAS 探针，8k Hz 的旋转速率，2 ms 的接触时间，5 s 的延迟回收，4 000 的累积。

1.6 黑木耳黑色素F1 的元素组成

黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素的C、H、N、S 百分比含量通过元素分析仪测定，条件为氧化管温度1 150 ℃，还原管温度850 ℃，试验在高纯度氦气和氧气的环境下进行。

2 结果与分析

2.1 黑木耳黑色素F1 的紫外可见光谱特征

将层析分离得到的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素进行紫外可见光谱扫描得到紫外光谱特征图谱（图1）。可以看出黑木耳黑色素的最大吸收峰值在紫外波长207 nm 处，黑木耳黑色素F1的最大吸收峰值在紫外波长212 nm 处，在所设定的200～600 nm 的紫外可-见光谱扫描范围内在紫外区具有强吸收，从最大吸收峰值处开始，随着扫描波长的逐渐增大，吸光度呈下降的变化趋势，具有典型的黑色素紫外吸收图谱特征，这与现有文献所报道的不同来源的黑色素的紫外可见光最大吸收峰值在波长在210 nm 附近具有较高的一致性。

图1 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的紫外扫描图谱

2.2 黑木耳黑色素F1 的微观形态

由图2A 可见，黑木耳黑色素是由表面不规则的球形单体组成，并且呈层层堆叠结构，通过软件测量黑木耳黑色素单体平均粒径约为1 μm。大量黑木耳黑色素单体聚合，形成图2B 所示的较大体积的不规则块状形态，但是表面的气孔表示黑木耳黑色素的结合并不紧密。

黑木耳黑色素F1有更明显的片层结构，且表面比黑木耳黑色素光滑，单体间结合的更加紧密（图2C）。黑色素F1大量聚合后，同样形成较大体积的不规则块状形态，但表面比黑色素更光滑致密，说明单纯黑色素F1比黑色素结合的更加紧密，单体与单体之间的连接更加坚固（图2D）。

图2 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的扫描电镜图

2.3 黑木耳黑色素F1 的红外光谱特征

将层析得到的黑木耳黑色素F1经溴化钾压片，傅里叶红外光谱扫描得到红外光谱扫描特征图谱（图3）。黑色素F1的结构特点与复杂的生物大分子的结构特点十分相似，具有多种官能团才得以使其红外光谱扫描图中具有多个宽而强的吸收峰。

图3 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的傅里叶红外扫描图谱

在黑木耳黑色素F1红外光谱扫描图谱中，在3 200 cm-1附近出现的宽峰，是由OH 和NH2基团伸缩振动引起的；在2 950～2 850 cm-1处的吸收峰说明有脂肪族C-H 的存在；1 650～1 500 cm-1处的强烈吸收，与芳香族C=C 和COO 的振动有关；1 400～1 200 cm-1位置的吸收峰显示酚类COH 和吲哚以及NH 的存在；800～600 cm-1范围的相对小的吸收峰代表着芳香环的存在。在黑木耳黑色素的红外光谱图谱中，同样有这些吸收峰。此外，黑木耳黑色素在1 711.98 cm-1处的吸收峰可能是由于-NH 结构及其间的氢键的弯曲和振动引起的，表明黑色素相比于黑色素F1有更多含量的蛋白质结合在黑色素上。

2.4 黑木耳黑色素F1 的分子结构特征

如图4 所示，在1H NMR 光谱中，0.8～1.0 ppm 范围为脂肪族区，出现的信号认定为烷基片段的CH3基团，例如CH2CH3、CH(CH3)2，可能来自残留的蛋白质；在2.0 ppm 附近的信号是属于亚甲基或酯基(-OCOCH3)，表明羧酸结构的存在；在4 ppm 周围的峰被认定为结合于吲哚或吡咯环的甲基（NCH3）和结合到环上的第一个位置的-OCH3；6.5和7.3 ppm 的信号是吲哚或吡咯环的芳香族氢原子；8.5 ppm 附近的信号是吲哚或吡咯环上的羧基质子，其中位置在5 ppm 出现的强信号是溶剂中NaOH 中H 的峰。通过强酸前后两次高温水解，仍然存在一部分的蛋白质，这表明黑木耳黑色素密切结合于蛋白质形成一个非常稳固的结构。

图4 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的1H NMR 扫描图谱

在黑木耳黑色素的图谱中，2.0 ppm 附近的信号强于黑木耳黑色素F1，说明黑木耳黑色素的羧酸结构比例更高；4ppm 周围的峰面积小于黑木耳黑色素F1，代表吲哚或吡咯环的比例较小。

由于黑木耳黑色素以及黑色素F1是大分子聚合物，含有的C 原子较多，所以扫描得到的13C NMR图谱中有多而密的峰。如图5 所示，光谱可分为三个区域：脂肪族区（10～95 ppm），其主要是指酸水解后仍然结合于黑木耳黑色素的蛋白质、烷基和未环化的连接到黑色素的L-DOPA。特别是，在35和55 ppm 附近的峰分别是结合到吲哚或吡咯环上的甲基（N-CH3），和结合至环上的OCH3或未环化的L-DOPA 上结合的CH2或CH。芳香族区（95～145 ppm），这对应于黑色素的吲哚和吡咯基团，这些峰主要是构成主要骨架的C，不能够确定的指到黑色素单体单元每一个C。羰基区（160～200 ppm），这对应于含有肽键与侧链羧基和酰胺基团的羰基主链，通常约在175 ppm。

图5 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的13C NMR 扫描图谱

在黑木耳黑色素F1的图谱中，脂肪族区（10～95 ppm）的信号峰略少于黑木耳黑色素，说明黑木耳黑色素的羧酸结构比例更高；140 ppm 周围的芳香族区（95～145 ppm）的峰面积大于黑木耳黑色素，代表吲哚或吡咯环的比例较高，更加稳固；羰基区（160～200 ppm）信号弱与黑木耳黑色素，也证实了羧基的比例较低。以上结果与1H NMR 图谱相互印证，证明黑木耳黑色素含有更多的蛋白质，而黑木耳黑色素F1含有更多的用来构成骨架的吲哚或吡咯环。

根据1H NMR 图谱和13C NMR 图谱并结合红外光谱扫描特征图谱得到基团和结构信息，对黑木耳黑色素的单体化学式做出预测，如图6 所示，吲哚环为黑木耳黑色素的主体结构，在环上结合着-COOH 和-OR 等基团。

图6 黑木耳黑色素单体化学式

从表1 可知，黑木耳黑色素的N、C、H、S 元素的含量均高于黑木耳黑色素F1。其中，黑色素的N含量为10.38%高于黑色素F1的N 含量，说明黑木耳黑色素可能含有更多的蛋白质，这与傅里叶红外扫描图的结果相互印证。

表1 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的元素含量

黑色素按合成途径分类，可以分为真黑色素，棕黑色素和异黑色素3 种。真黑色素主要是由酪氨酸、多巴、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成的；棕黑色素也是由酪氨酸、多巴、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成的，其中有半胱氨酸或谷胱甘肽的参与，含有硫和氮原子[5]；异黑色素是在多酚氧化酶存在的情况下通过多酚的氧化聚合而成的[6,7]。有文献指出合成的真黑色素中硫元素含量为0.09%，棕黑色素的硫元素含量为9.78%，而异黑色素中不含有硫元素[iv]。黑木耳黑色素F1中硫元素含量为0.698%，数值介于两者之间，说明同时含有这两种黑色素，借助文献所报道的数据通过计算，真黑色素：棕黑色素含量比为13.29∶1。而黑木耳黑色素中硫元素含量为0.943%，与文献报道的0.94%有较高的一致性，且真黑色素：棕黑色素为10.36∶1，说明黑木耳黑色素含有更多的棕黑色素。

3 结论

本文确定了黑木耳黑色素改善小鼠缺铁性贫血的功效组分为黑木耳黑色素F1，并确定了其基本化学基团的骨架结构，理化性质试验表明黑木耳黑色素F1的稳定性优于另外两种组分，为后续治疗缺铁性贫血的新型安全的食品药品开发研究奠定了基础。