响应面法优化牡蛎蛋白酶解工艺的研究

梁瑞萍，谢 超，梁 佳，何定芬，李海波

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316021)

牡蛎Crassostrea gigas Tnunberg，俗称生蚝，属于翼形亚纲牡蛎目。牡蛎作为一种重要的海洋生物，其药用价值和营养价值非常丰富，主要营养和药用成分是牛磺酸[1]、蛋白质、维生素[2]、DHA[3]、EPA[4]矿质元素钙以及生物活性肽[5]等成分，能够有效降血压、抗氧化、抗肿瘤及提高免疫力等特殊功能[6]。舟山长牡蛎也是一种常见的牡蛎品种，具有生长快且环境适应性强的优点。

目前，有关长牡蛎活性物质的提取和研究工作逐渐展开，为牡蛎在营养和医疗保健方面提供了新的思路。牡蛎软体部分不仅蛋白含量尤为丰富，还表现出低脂肪的营养特点，又因其结构齐全的氨基酸组成也成为人们疯狂追捧的食物[7-8]。目前提取牡蛎蛋白的方法各种各样，其中包括化学合成法、基因工程法、从一些动植物组织中直接提取法以及酶解法[9]等手段。酶水解法具有反应条件温和而且实验过程易于控制的特点，在蛋白的提取中被广泛运用。利用酶法对蛋白质资源进行深加工，生产具有生物活性的多肽，是实现蛋白质高价值利用的重要途径之一，酶法制备具有一定生理作用的牡蛎活性蛋白肽具有广阔的市场发展前景[10]。

梁晓芳等[11]研究了不同种类扇贝通过多种酶的水解作用，发现中性蛋白酶水解效果最佳且得到具有强抗氧化活性的酶解产物；李婷菲等[12]研究毛蚶碱性蛋白酶水解肽，发现碱性蛋白酶能够很好地酶解得到高价值的蛋白；马铭研等[13]以厚壳贻贝多糖提取率为指标，通过酶解法提取出贻贝多糖，并设计响应面优化实验方案得到最佳酶解工艺，此条件下的多糖组分能够检测到明显的免疫力提高效果。本论文主要以酶添加量、pH、酶解温度为变量因素，以牡蛎蛋白质的氨基态氮(AAN)为蛋白酶解程度指标，研究牡蛎软体部分蛋白质酶解的方法，通过响应面优化设计酶解工艺条件，以期为合理开发，提高牡蛎高值化资源利用率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验原料及试剂

牡蛎：由浙江舟山常青海洋食品有限公司提供，牡蛎去壳洗净泥沙后沥干，得到干净的牡蛎肉后用高速匀浆机捣碎均质待用。化学试剂酒精，冰醋酸，盐酸，氢氧化钠，甲醛等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。风味蛋白酶、木瓜蛋白酶，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

NZ-100 高速均质机 上海爱朗仪器有限公司；HC-1016 高速离心机 日本日立公司；HH-4 恒温水浴锅常州市金坛友联仪器研究所；电子天平；pH 计 上海精密仪器有限公司；IKA 磁力搅拌器 郑州南北仪器设备有限公司。

2 实验方法

2.1 原料预处理

将-18℃冷冻牡蛎取出解冻，取出软体部分，将牡蛎的软体部分清洗干净，备用。

2.2 牡蛎蛋白的提取工艺

取一定量的牡蛎软体部分，用高速均质机捣碎牡蛎肉，按照一定的液料比加入蒸馏水后开始均质匀浆，用稀盐酸和氢氧化钠调节牡蛎蛋白液的酸碱环境，加入适量的蛋白酶后放置于设定好的温度条件下开始酶解，酶解相应的时间后开始灭酶，加热温度到90℃以上并维持10 min，待酶解液冷却后5 000 r·min-1离心20 min 收集蛋白清液。

2.3 氨基态氮(AAN)含量测定

氨基态氮采用甲醛滴定法[14]。蛋白质水解成氨基酸，是氮元素以氨基酸形式存在的。多肽是氨基酸脱水缩和形成的聚合物，本质上是不是氨基酸，在甲醛滴定法中，甲醛是遮蔽剂，它能够屏蔽氨基酸中的氨基，然后用NaOH 滴定测得羧基含量，根据氨基酸结构公式，即可得出氮元素的含量，多肽也会有游离羧基，因此氨基态氮指标代表酶解液中游离氨基酸和多肽的总和，可以反映牡蛎蛋白水解程度。

酶解前牡蛎肉为10 g，取5 mL 酶解上清液至250 mL 的烧杯中放入磁石，加入60 mL 蒸馏水稀释并将烧杯置于磁力搅拌器上，调整合适的转速值，用0.05 M 的Na0H 标准溶液滴定至8.2 记录其体积数，第二步在加入浓度比为40 %的中性甲醛并混匀后，用0.05 mol·L-1的NaOH 标准溶液滴定，记录到pH 为9.2 时的NaOH 体积数，记为V1。每组重复试验3 次平行，并且要做空白对照试验得到体积数V2。

氨基态氮的含量计算：

2.4 酶的选择

牡蛎软体部分酶解：取10 g 牡蛎肉，加一定量的蒸馏水，以氨基态氮(AAN)含量为评价蛋白质提取量的指标，筛选出以下5 种不同种类蛋白酶，分别是胰蛋白酶、中性性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，对应酶分别在酶活力最适宜的温度几pH 条件下进行试验(表1)。其他实验因素分别设定为：酶添加量为0.8%，酶解时间4 h，开水煮沸灭酶10 min，5 000 r·min-1离心10 min，选择酶解牡蛎蛋白最合适的蛋白酶。

表1 不同种类蛋白酶对牡蛎软体部分的酶解效果Tab.1 The enzymatic hydrolysis effect of different kinds of proteases on oyster soft parts

2.5 单因素实验

(1)酶添加量对AAN 含量的影响：取酶添加量为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0 %，其他酶解条件为pH 7，温度55℃，时间5 h，考察牡蛎软体部分氨基态氮(AAN)含量的变化情况选取适宜酶添加量。

(2)pH 对AAN 含量的影响：取pH 为5.5、6、6.5、7、7.5，此时实验中还要设置不变量为：酶添加量1.6 %，酶解温度55℃，酶解时间5 h，液料比1:1，考察牡蛎软体部分AAN 含量的变化情况选取适宜酶解的pH。

(3)酶解温度对AAN 含量的影响：取酶解温度为45、50、55、60、65℃，其他酶解条件为液料比1:1，酶解液pH 7，酶解时间5 h，酶添加量1.6 %，考察牡蛎软体部分AAN 含量的变化情况选取适宜酶解温度。

(4)酶解时间对AAN 含量的影响：通过研究考虑设置单一变量4、4.5、5、5.5、6 h 进行不同条件的酶解，此时实验中还要设置不变量为酶添加量1.6 %，酶解液的pH 7，酶解温度55℃，液料比1:1，测定牡蛎软体部分AAN 含量的变化情况选取适宜酶解时间。

(5)选取去离子水和牡蛎肉的含量比分别是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，此时实验中还要设置不变量为酶解温度为55℃，酶解时间为5 h，酶解pH 为7，添加酶量1.6 %，考察牡蛎软体部分AAN 含量的变化情况选取适宜酶解液固比。

2.6 响应面优化实验

选择风味蛋白酶作为最佳的酶制剂。根据单因素实验结果，选取酶添加量(A)、pH (B)和酶解时间(C)3个因素为实验变量，实验将对这三因素的最佳条件进行探索和优化(表2)。

表2 牡蛎酶解条件三因素水平表Tab.2 Table of three factors of oyster enzymatic hydrolysis conditions

2.7 数据处理

实验所得数据通过origin 9.0 进行处理，用Design-Expert11分析进行显著性分析。检测各组分之间的差异，显著性水平设定P＜0.05。

3 讨论

3.1 酶制剂的选择

不同蛋白酶对氨基态氮(AAN)含量的影响如图1 所示。不加酶的空白组经一系列处理后测得的氨基态氮是1.61 mg·g-1，其余5 种不同蛋白酶处理实验结果显示，蛋白酶的添加可以使蛋白质的水解效果改善。其中牡蛎蛋白酶解作用最强的是风味蛋白酶，测得氨基态氮含量5.21 mg·g-1，其次是中性蛋白酶，酶解后氨基态氮含量5.18 mg·g-1，另外3 种蛋白酶酶解后氨基态氮含量都高于空白组测得的氨基态氮含量。综上选取风味蛋白酶作为实验酶来酶解牡蛎软体部分，从而提取牡蛎蛋白。

3.2 酶添加量对氨基态氮(AAN)含量的影响

酶添加量对牡蛎软体部分氨基态氮(AAN)含量的影响如图2所示。由图2 可知，风味蛋白酶能够很大程度上促进牡蛎蛋白进行酶解，且氨基酸氮(AAN)含量先升高后降低，且上升的趋势明显高于下降的趋势。当风味蛋白酶添加量为1.2 %时，牡蛎软体部分测得的氨基态氮含量达到最大值7.64 mg·g-1。蛋白酶往往只有与蛋白质充分接触时，才能发挥作用，一旦酶与底物的作用开始达到饱和状态时，过度酶解导致部分小分子物质与蛋白又发生乳化，产生絮状类物质，使氨基态氮(AAN)含量降低[15]。综合实际生产加工经济因素，酶解牡蛎软体部分时，酶添加量为2.0%。

3.3 酶解pH 对氨基态氮(AAN)含量的影响

由图3 可知，酶解pH 值对牡蛎软体部分AAN 含量的影响结果。随着pH 值的提升，AAN 含量先增加后下降，当pH 达到6.5时，牡蛎软体部分氨基态氮含量达到最大值5.74 mg·g-1，牡蛎蛋白在偏中性时风味蛋白酶活性达到最佳作用效果，此时牡蛎蛋白的酶解程度最好。故牡蛎软体部分经风味蛋白酶酶解作用时最适pH 为8.5。

3.4 酶解温度对氨基态氮(AAN)含量的影响

图1 不同种类蛋白酶水解度的比较Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of different proteases

图2 不同酶添加量对氨基态氮(AAN)含量的影响Fig.2 Effects of different enzyme additions on amino nitrogen (AAN) content

图3 酶解pH 对氨基态氮(AAN)含量的影响Fig.3 Influence of pH value of enzymatic hydrolysis on the content of amino nitrogen(AAN)

由图4 可知，不同酶解温度对牡蛎软体部分AAN 含量的影响。AAN 含量随着温度的上升先增大后减小，原因是蛋白酶生理活性在最适温度55℃时达到最高时，测得牡蛎蛋白酶解液中氨基态氮含量为5.33 mg·g-1，温度对酶活性的影响较明显。所以，较适宜的酶解牡蛎软体部分的温度为55℃。

3.5 酶解时间对氨基态氮(AAN)含量的影响

由图5 可知，酶解时间对牡蛎软体部分AAN 含量的影响较大。蛎软体部分酶解液中氨基态氮的含量随时间增加而增多，酶解时间5.5 h 时，牡蛎酶解液中氨基态氮含量为5.63 mg·g-1。5.5 h 后，牡蛎酶解液中氨基态氮含量与酶解时间的作用程度明显降低，并且随时间延长牡蛎酶解液颜色发生变化，逐渐变深。因此，风味蛋白酶酶解牡蛎蛋白最好时间控制在5.5 h。

3.6 液料比对氨基态氮(AAN)含量的影响

牡蛎软体部分AAN 含量与液料比的关系如图6 所示。液料比小于2 :1 时，加入蒸馏水越多，酶解效果越好；液料比为2 :1 时，酶解液中氨基态氮含量为5.58 mg·g-1；当液料比大于2 :1 后，水解程度逐渐减小，原因是当酶解液中水量增加，过多的牡蛎蛋白底物聚集于风味蛋白酶的结合位点，影响产物分子的扩散从而减缓酶解速度，而当蒸馏水逐渐变多时，酶解液中风味蛋白酶的浓度也随之降低，酶解效果随之减弱[16]。因此，风味蛋白酶酶解牡蛎肉选择最佳液料比为1:1。

图4 不同酶解温度对氨基态氮(AAN)含量的影响Fig.4 Effects of different enzymatic hydrolysis temperatures on the content of amino nitrogen (AAN)

图5 不同酶解时间对氨基态氮(AAN)含量的影响Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis time on the content of amino nitrogen (AAN)

图6 不同液料比对氨基态氮(AAN)含量的影响Fig.6 Influence of different liquid/material ratios on the content of amino nitrogen (AAN)

3.7 响应面优化实验

根据表2 的设计对酶添加量(A)、pH(B)和酶解温度(C)这3 个实验变量进行3 因素3 水平的牡蛎蛋白酶解响应面优化实验，以牡蛎软体部分酶解液中AAN 含量为考察指标，所得实验结果如表3。

表3 酶解反应响应面实验分析及结果Tab.3 Response surface analysis and results of enzymatic hydrolysis reaction

通过Design-expert 11 软件可得回归方程方差分析表4，响应面实验分析所得AAN 对酶添加量(A)，pH(B)和酶解温度(C)的多元二次回归方程为：

Y=-132.289 63+44.319 58 A+33.575 38 B+1.891 34 C+0.380 150 AB-0.647 192 AC+1.141 29 BC-17.706 59 A2-3.116 43 B2-0.841 967 C2。

由表4 中F 值可以看出，在酶添加量，pH 和酶解温度这3 个因素中，pH 对酶解液中AAN 含量的影响最大，其次为酶添加量和酶解时间。同时，由上表可以看出，模型P 值为0.003 4，极显著(P＜0.01)；失拟项P=0.348 0，不显著(P＞0.05)，说明该模型为回归显著型，相关系数为0.925 4，说明拟合性高，实验设计相对来说时可靠的。根据P 值可以看出，pH 对牡蛎蛋白酶解作用显著(P＜0.05)，3 个影响因子对AAN 含量影响的排序：pH＞酶添加量＞酶解时间，其中A2、B2、C2的作用极显著(P＜0.01)，BC 的作用具有显著性(P＜0.05)。因此，使该用回归方程表示牡蛎蛋白酶解液氨基态氮含量的分析和预测是可以参考的。

表4 数据回归分析结果Tab.4 Data regression analysis results

另外，图响应面值对各因素之间关系构成的平面图和三维曲面图，能很好的分析出各因素之间的相互影响以及得出实验设计的最佳参数。

图7 表示酶解时间为定量因素时，酶添加量和酶解pH 共同作用对酶解液中氨基态氮(AAN)含量影响变化的趋势。由等高线图7(A)和响应曲面图7(a)可知，等高线随酶解pH 的增大而变化的曲线密集程度大于等高线随酶添加量增大而变化的曲线密集度，所以可以看出此时酶添加量和酶解pH 交互作用中，酶添加量的影响稍大于酶解pH。

图7 酶添加量和pH 的平面图和三维曲面图Fig.7 Planar and three-dimensional graphs of enzyme addition and pH

对比图8 (B) 可知，酶解时间对应的等高线密集程度大于酶添加量的等高线密集程度，由图8(b)可知，二者同时的对牡蛎酶解液氨基态氮含量的影响较大。

图8 酶添加量和酶解时间的响平面图和三维曲面图Fig.8 Planar and three-dimensional graphs of enzyme addition and enzymatic hydrolysis time

图9 为不考虑酶解添加量对牡蛎蛋白酶解效果影响，2 种变量因素酶解时间和pH 对牡蛎酶解液中氨基态氮(AAN)含量的影响直观图如响应面图9(C)和等高线图9(c)。当酶解时间确定时，氨基态氮(AAN)含量随pH 的增大而提高；当达到一定值时，氨基态氮(AAN)含量又会随酶解时间的增大而降低。而pH 一定时，氨基态氮(AAN)含量随酶解时间的增加，先减少后增加，达一定值时又出现减少的趋势。综上可看出，二者之间的交互作用明显。

图9 pH 和酶解时间的平面图和三维曲面图Fig.9 pH and enzymatic hydrolysis time of the planar and three-dimensional surface diagram

3.8 最佳提取条件预测及验证

经响应面优化后，得到最优参数为酶添加量1.33%，pH 为6.919，酶解时间为4.763 h，此时牡蛎酶解液中AAN 含量的理论值为5.416 mg·g-1。考虑到实际生产要操作方便，确定AAN 含量的最佳工艺参数指标为：酶添加量1.3%、酶解液的pH7、酶解时间5 h，测定实际牡蛎酶解液的氨基态氮含量值以验证响应面试验的可行性。进行3 次试验，结果测得AAN 含量的平均值为5.59±0.25 mg·g-1，基本符合响应面优化方案中的理论值。综上，此蛋白酶解响应面优化实验中得到的最佳工艺参数具有良好的可行性。

4 结论

本研究以牡蛎蛋白为研究对象，用不同种类蛋白酶对牡蛎软体部分中蛋白进行生物酶法提取。研究结果表明，风味蛋白酶提取牡蛎蛋白的效果最好，氨基态氮含量达到5.21 mg·g-1。通过响应面法对风味蛋白酶酶解参数进行优化实验，得出牡蛎蛋白经预处理后：酶添加量1.3%、pH 7、酶解时间5 h 的条件下氨基态氮(AAN)含量达到最高5.59±0.25 mg·g-1。牡蛎酶解物中氨基态氮含量能够反应牡蛎蛋白的酶解程度，其酶解程度一般呈现先增后减的趋势，是由于随着酶解程度的加剧，牡蛎蛋白多肽被分解成氨基态氮化合物以及游离氨基酸，导致产物有所变化。因此，若要提取出具有特殊活性的牡蛎蛋白多肽要适当控制合适的酶解程度，进一步优化酶解条件。该研究结果将为牡蛎蛋白酶解工艺带来一定的指导意义。