主动靶向纳米粒子治疗结直肠癌的研究进展*

周立强， 辛林

南昌大学第二附属医院胃肠外科(江西南昌 330006)

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，有数据显示，其居于我国恶性肿瘤发病率的第5位、病死率第5位[1]。目前主要通过手术结合辅助化疗的方式治疗结直肠癌。但化疗药物存在可溶性差、毒副作用大等劣势。另外，肿瘤多药耐药性(MDR)也是其难以解决的问题。随着纳米技术研究不断深入，发现纳米载体封装药物有解决这些传统药物局限性的巨大潜力[2]。靶向治疗根据作用靶点可分为主动靶向和被动靶向。被动靶向是利用纳米粒子可通过实体瘤高通透长滞留(EPR)效应被动地到达肿瘤组织，稳定可控地释放药物[3]，从而增强抗肿瘤作用。而主动靶向纳米粒子在被动靶向基础上利用偶联在纳米载体上的抗体、适配体、叶酸(FA)、透明质酸(HA)等配体特异性结合癌细胞表面受体，使亲和性更高，从而达到更好的治疗效果。偶联在纳米载体上的靶向配体还可以避免被内皮网状系统(RES)识别，进而延长其血液循环时间[3]。所以，主动靶向纳米粒子有希望成为一种有效治疗结直肠癌的方式。

1 抗原-抗体靶向

抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化形成的浆细胞生成，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。目前治疗肿瘤最成熟的特异性抗体是单克隆抗体，其中以表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)为靶点的抗体为主。通过抗体官能化的纳米载体使其特异性识别肿瘤细胞的相应抗原，有效的将药物输送到肿瘤细胞，并减小免疫原性。

1.1 靶向表皮生长因子受体 EGFR是具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性的一个巨大的跨膜糖蛋白，包括ErbB2/HER2/Neu，ErbB3/HER3和ErbB4/HER4三种。其在乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中过度或异常表达，具有可以调节多种基因活性，参与肿瘤细胞发生、发展和凋亡等生物学功能。针对EGFR抗体的研究较充分，帕尼单抗、西妥昔单抗等单克隆抗体已在临床广泛应用。Zalba等[4]设计一种利用西妥昔单抗(CTX)官能化负载奥沙利铂(L-OH)的脂质体针对转移性结直肠癌(CRC)，实验表明EGFR受体可靶向负载L-OH的脂质体，使肿瘤内L-OH积累增多，并且表现了显著的肿瘤细胞毒性和抑制肿瘤的生长效应，并且可以逆转L-OH抗性。

1.2 靶向血管内皮生长因子(VEGF)受体 瘤组织需要足够的血液运输氧和营养物质维持其生长，而VEGF与肿瘤组织的血管生成密不可分。与VEGF结合受体VEGFR可分3类，VEGFR-1和VEGFR-2主要分布在肿瘤血管内皮表面，调节肿瘤血管的生成、增加血管通透性。另外，VEGFR-2因为与VE-钙粘蛋白表达显著相关，可能有助于结肠癌细胞获得内皮细胞的分化潜能[5]。VEGFR-3主要分布在淋巴内皮表面，调节肿瘤淋巴管生成，并促进增殖转移[6]。Lee等[7]将伊立替康(SN-38)、超小型超顺磁性氧化铁纳米粒子 (USPIO)与VEGF小干扰RNA聚乙二醇复合物(VEGF siRNA-PEG)装载到PDMA-嵌段-聚(ε-己内酯(PDMA-b-PCL)胶束形成胶束复合物，他们发现VEGF siRNA胶束复合物对VEGF表达都显示出良好的沉默效应和显著的与SN-38协同的肿瘤抑制效应。通过这个研究，也可证实VEGFR作为主动靶向受体治疗结直肠癌的可行性。目前，针对VEGF通路的贝伐单抗、雷莫芦单抗等药物已经被广泛使用。

2 核酸适配体靶向(Apt)

Apt是一段人造DNA、RNA序列。Apt能结合的目标分子范围很广，而且表现出高亲和力和高特异性。Apt特异性更强可以更好的内化到肿瘤组织中[8]，且Apt可以更快、更低廉地制备[9]。所以，Apt作为靶向配体优势更突出。

2.1 靶向核仁素蛋白(NCL) NCL是真核细胞核仁中最主要的一种非组蛋白磷酸蛋白质。癌细胞中，高水平的NCL具上调致瘤性RNA的功能，促进细胞的恶性转化[10-11]。此外，NCL在促进癌细胞增殖[12]、促进肿瘤细胞浸润与转移等发挥了重要的作用。核仁素核酸适配体(AS1411)可以高特异性结合癌细胞表面的NCL。AS1411与NCL结合，上调p53和下调Bcl-2、AKT1，抑制肿瘤细胞生长、增殖[10]。Mosafer等[13]开发了用AS1411修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)装载多柔比星(Dox)共负载聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒子，结果证实AS1411-NCL相互作用可以有效增强C26癌细胞对靶向纳米粒子内化，从而增强Dox的细胞毒性作用，并具有显著的抑制肿瘤生长和更长的动物存活时间。然而，有效的杀灭癌细胞需要长时间维持有效作用浓度，需要药物表现出可持续的释放。Alibolandi等[9]合成喜树碱(CPT)聚乙二醇化(PEG)的树枝状大分子(PAMAM)，并用AS1411进行官能化组成Apt-PEG-PAMAM-CPT，因为Apt-PEG PAMAM-CPT表面上适配体的存在，CPT从PAMAM树枝状大分子腔中缓慢释放[14]。

2.2 靶向粘蛋白1(MUC1) MUC1是一类高度糖基化的蛋白质。MUC1在各种腺和腔的正常上皮细胞顶端表达、极性分布，细胞癌变后可在细胞表面所有区域大量表达。有研究发现，MUC1表达与肿瘤分化有显着相关性，随恶性程度升高表达升高[15]。MUC1在肿瘤细胞中具有促使肿瘤细胞对正常细胞的黏附并减少肿瘤细胞间的黏附力、促进肿瘤细胞发生、抑制肿瘤细胞凋亡等作用。因此，MUC1作为治疗结直肠癌的靶向受体有很好的前景。Taghavi等[16]开发了针对MUC1的5TR1 适配体，用其修饰用壳聚糖(CS)改性的装载了EPi的PLGA组成Epi-PLGA-CS-Apt，结果表明5TR1适配体在细胞摄取中发挥重要作用，使Epi-PLGA-CS-Apt对肿瘤细胞具有高度特异性，表现出良好的内化作用，体外实验显示了显著的肿瘤生长抑制。

2.3 靶向上皮细胞粘附分子(EP-CAM) EP-CAM是一种嗜同种非钙离子依赖性上皮细胞黏附分子，可以介导非钙离子依赖性同源细胞间的粘附。Xie等[17]将树突状纳米材料与EP-CAM和唾液酸化路易斯寡糖(X Slex)抗体结合，实验发现了antiEP-CAM/EP-CAM相互结合作用，在抑制黏附和癌细胞活力过程中起关键作用。EP-CAM在正常细胞中呈弱表达或阴性表达，在多种上皮源性癌细胞表面表达，包括胃癌、结直肠癌等。有研究表明，Ep-CAM沉默可以显著抑制结直肠癌细胞的增殖[18]。此外，其与癌细胞的去分化、侵袭及转移等也起重要作用。Xie等[19]开发出针对EP-CAM 的适配体修饰负载DOX的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)，组成Apt-MSN-DOX，结果显示抑制EP-CAM的表达是由于适配体的存在，Apt-MSN-DOX相比MSN-DOX的细胞摄取更高，从而表现了更强的诱导凋亡能力； 适配体对纳米粒子抑制EP-CAM表达的能力可能与DOX具有协同作用，可减少EP-CAM过表达癌细胞的增殖。

3 受体介导靶向

受体介导的主动靶向是指利用肿瘤高度表达的特异性受体为靶点，利用相应配体修饰纳米载体，将药物运输到阳性表达受体的肿瘤细胞中，表现出了更好的特异性、生物相容性。靶向部分和肿瘤部位特异性受体之间的相互作用可以改善纳米粒子对特定细胞的生物黏附，并通过受体介导的内化进一步增加内吞程度。

3.1 靶向细胞因子受体

3.1.1 靶向肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(TRAIL) TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，属于Ⅱ型跨膜蛋白质。TRAIL具有选择性诱导肿瘤凋亡的能力，在多种癌细胞中表达。TRAIL有5种特异性结合受体，死亡受体4(TRAILR1/DR4)，死亡受体5(TRAIL-R2/DR5)能够在TRAIL结合时转导凋亡信号。Thao等[20]制备了TRAIL(0.2%,0.4%,1.0%)和负载Dox的人血清蛋白(HAS)纳米颗粒(TRAIL/Dox-HAS-NPs)，实验表明TRAIL 1.0%/ Dox HSA NPs显示HCT116结肠癌细胞的最佳抑制作用，相对于Dox HSA NPs，TRAIL 1.0%/ Dox HSA NPs表现出更高的靶向性和稳定性，而且Dox和TRAI表现了协同抗肿瘤活性。有研究表明，通过激活DR5死亡受体，TRAIL依赖途径诱导凋亡活性升高，并在蛋白质印迹显示具有抗凋亡作用的Bcl-2和存活蛋白表达降低[21]。De Miguel等[22]合成了类似于天然外来体的含有膜结合TRAIL(LUV-TRAIL)的人造脂质纳米粒子，发现LUV-TRAIL比CRC细胞系中的sTRAIL显示出更高的细胞毒性能力和更大的诱导细胞凋亡的能力，主要区别是它们相对于激活DR5的能力。这表明DR5受体作为靶向配体是更好的选择。

3.1.2 靶向白细胞介素-4α受体(IL-4Rα) 白细胞介素-4(IL-4)由可由肥大细胞、嗜碱性粒细胞及活化的T淋巴细胞产生。IL-4可以通过结肠癌、乳腺癌等癌症自分泌，在抗肿瘤生长，化疗诱导的细胞死亡和对死亡受体的抵抗力方面起重要作用。IL-4Rα是IL-4和IL-13的受体，也在多种实体瘤中表达。在结肠癌组织中观察到比临近组织更高的IL-4Rα表达[23]。研究发现，人动脉粥样硬化斑块特异性肽-1(AP-1)具有与IL-4Rα特异性结合的能力[24]。因此，AP1可作为靶向治疗结直肠癌的配体。Yang 等[23]使用AP-1结合的脂质体装载DOX靶向治疗结肠癌，AP-1与IL-4Rα结合更有效地内化纳米粒子于IL-4Rα过表达的CT26细胞中，显著的抑制肿瘤细胞生长，而且表现出较低的副作用。

3.2 靶向叶酸受体(FR) FR是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的跨膜单链糖蛋白。有研究发现叶酸受体在正常细胞中低表达或不表达[25]，在一些结直肠癌、乳腺癌等癌细胞中高度表达。FA是对FR亲和力很高的一种天然配体。重要的是，当FA与其他分子结合时，可以保持这种亲和力，其能使靶向叶酸化的药物或NPs运输到表达FR的肿瘤细胞[26]。Le等[27]合成了FA/5-FU/NPs，结果表明FA/5-FU/NPs组更显著的细胞毒性，更强的抗肿瘤效能，Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达更高。肿瘤多药耐药性是有效癌症治疗的主要障碍之一，其中p-糖蛋白(PgP)能量依赖外排泵是其中一种重要的机制。Patel等[28]合成具有和不具有FA靶向配体的两种尺寸的载有Dox的中空二氧化硅纳米颗粒，发现小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)的PgP泵表达低于人上皮结肠直肠腺癌细胞(Caco2)，游离的Dox对3T3细胞的抑制优于Caco2细胞，而DOX-HSFA对Caco2抑制优于3T3，证实了HA修饰纳米粒子可以避免PgP泵的外排出作用。El-Hammadi等[26]研究了FA-PEG-PLGA NPs靶向递送5-FU对结肠癌和乳腺癌的潜在用途，也发现FR介导内吞作用不仅可以增加细胞内药物浓度，而且可以避免P-gp泵的外排作用[29]。

3.3 靶向CD44受体 CD44是在各种癌细胞中普遍存在的以不同水平表达的的跨膜糖蛋白[30]，CD44在一些原发性和转移性结肠癌的表面高度表达[31]。其主要参与肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，这种性质在肿瘤细胞侵袭转移中起重要的作用。HA是对CD44表现出了高亲和力的配体。HA与CD44形成复合物，遇胞内溶酶体，在酸水解酶作用下使缀合在纳米载体上的HA降解进而导致载体内药物释放。HA官能化的纳米粒子有在多种癌细胞中表达且随着癌症的进展而增加、对受体的高亲和力等优点[32]。另外，恶性肿瘤细胞富含透明质酸酶可迅速降解HA成片段，从而加速药物释放。Hou等[32]制备了负载5-FU的HA-共轭二氧化硅纳米粒子(SiNPs)靶向结肠癌细胞，结果表明HA-缀合的纳米颗粒中的药物可以稳定释放，表现了优秀的生物相容性和诱导癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长的能力，并有效降低5-FU的副作用。因为活性氧簇(ROS)可以解聚HA与CD44的结合，因此通过增加癌细胞内ROS水平可以进一步增加纳米粒子释放装载的抗癌药物，起到更好的治疗效果。Lin等[31]制备HA涂层壳聚糖(CS)和铜螯合剂D-青霉胺(D-pen)的生物可还原缀合物纳米粒子(HA/CS-SS-D-pen NP)，Dox和Cu(Ⅱ)离子以Cu(Ⅱ)-Dox络合物的形式并入其中，最后实验结果发现胞内ROS水平升高，Dox释放速率增加，从而证实了这一点。

3.4 靶向甘露糖受体(MR) MR为Ⅰ型跨膜蛋白，是先天免疫系统中重要的模式识别受体和内吞受体。MR 具有多个胞外结构域，能识别和结合广泛的内源性和外源性配体。MR在维持内稳态、识别病原、诱导细胞因子、抗原递呈等过程中发挥重要作用。在肿瘤细胞中MR与肿瘤淋巴转移[33]、免疫逃避等生物功能密不可分。近来研究显示 MR结肠癌组织中的表达显着高于癌旁组织[33]，其中在一些结肠癌细胞系如CT26和HCT116细胞中高度表达[34]。Xiong等[34]开发含有抗癌药物紫杉醇(PTX)的甘露糖基化脂质体，结果显示，由于靶向MR的作用，CT26细胞摄取效率和肿瘤抑制率较对照组显著升高，并且具有良好的生物安全性。

3.5 靶向B类I型清道夫受体(SR-BI) SR-BI是一种高密度脂蛋白(HDL)受体，参与体内胆固醇逆向转运。癌细胞通常过表达主要存在肝脏中的SR-BI，获得肿瘤生长所必需的额外胆固醇。SR-BI在多种肿瘤细胞系中高表达，结肠癌细胞中的SR-BI表达比人成纤维细胞高5～35倍[35]，而且结直肠癌进展与HDL下降相关[36]。因此，HDL与化疗药物结合可以靶向过表达SR-BI的结肠癌细胞，作为靶向治疗癌症的配体。Yuan等[35]开发一种由载脂蛋白A-I模拟肽(5A)构成稳定的高密度脂蛋白(sHDL)并含有0.5%～1.5%(w/w)的10-羟基喜树碱(HCPT)用于治疗结肠癌，结果表明与游离HCPT相比，细胞毒性HCPT-sHDL的IC50低约3倍，并且释放缓慢具有更高的血清浓度。

4 结语

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在中国发病率呈逐年增高的趋势。靶向治疗被认为是能够更有效治疗结直肠癌的方法。目前对主动靶向纳米颗粒研究较多，多种实验证实了其具有比传统化疗药物更好的治疗效果。而主动靶向治疗比普通靶向治疗有主动性更强、生物相容性更佳、药物释放更稳定并可以更有效减轻毒副作用等优点。纳米载体还可以利用自身的特点偶联其他小分子，从而可以增加化疗药物的溶解度、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。此外，通过抑制或增强一些主动靶向纳米粒的靶标的表达，也可以发挥抗肿瘤的效果，并通过其装载的化疗药物协同作用，增强抗肿瘤效果。总之，随着对主动靶向纳米粒子研究的不断深入，主动靶向纳米粒子将会发掘出更多的治疗潜力，在治疗肿瘤方面具有极大的前景。