新疆地区帕金森病患者与ATP13A2基因多态性的相关性

王 丹,李艳霞,高 华,杨新玲*

(1新疆医科大学第二附属医院神经内科,乌鲁木齐 830063;2新疆医科大学第二附属医院康复科;3新疆医科大学第五附属医院神经内科;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是当今仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统退行性疾病。该病在60-65岁人群中发病率约为0.5%-1%,而在80岁以上人群中其发病率上升至1%-3%[1,2]。PD患者可有渐进性的运动障碍,如静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势步态异常;以及复杂的非运动症状包括精神症状如抑郁、焦虑、认知功能减退和视幻觉,自主神经功能障碍如便秘、直立性低血压、性功能障碍,感觉症状如嗅觉减退、疼痛、肢体麻木,以及睡眠紊乱[3]。PD的发病机制复杂,目前尚未完全明确,目前研究认为老龄化、基因和环境因素均可能与PD发病相关[4]。虽然帕金森病中神经元变性的分子机制仍不完全明确,目前比较明确的是,遗传因素对该病的发病有重要的影响。最近的全基因组关联研究[5-7]已经确定了几个常见的基因,包括α-synuclein基因、LRRK2基因、Parkin基因、DJ-1基因、UCHL1基因、NURR1基因、PINK1基因、FBX07基因、PLA2G6基因、GIGyF2基因、GBA基因和ATP13A2(PARK9)基因等。近几年,ATP13A2基因成为PD基因遗传发病机制研究的热点之一。报道显示[8-10],ATP13A2基因是PD的易感致病基因,但在不同种族人群中,帕金森病患者ATP13A2基因的突变类型和突变频率还有所差异。新疆地区有着特殊的地理和人文环境,但目前对于新疆地区不同民族帕金森病患者ATP13A2基因多态性尚缺乏相关研究。我们通过SangerDNA测序技术检测并分析新疆地区汉族、维吾尔族帕金森病患者5个SNP位点的多态性,探讨ATP13A2基因多态性与帕金森病之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013-08～2018-03就诊于新疆医科大学第二附属医院神经内科的散发性PD患者218例为病例组,平均年龄(63.34±10.38)岁。汉族患者143例:其中男67例,女76例;维吾尔族患者75例:其中男45例,女30例。以上PD患者均符合以下纳入标准:①患者的临床表现均符合英国帕金森病协会脑库临床诊断标准[11];②长期生活在新疆地区(2代及以上);③临床资料完整且完善量表评估。排除标准:①脑血管病、外伤、脑炎、药物等所引起的帕金森综合征、帕金森叠加综合征、家族性帕金森综合征、肝豆状核变性患者;②伴有各种严重器质性疾病患者,如心肺功能不全、血液病、恶性肿瘤、肝肾功能不全者。同时选取就诊于新疆医科大学第二附属医院的健康体检者234例为对照组,其中维吾尔族90例,汉族144例。男性113例,女性121例,平均年龄(62.06±9.44)岁。病例组与对照组在年龄、性别、民族方面差异无统计学意义(P>0.05)。该研究经新疆医科大学伦理委员会认可,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

抽取外周静脉抗凝血2 ml,置于含800 μl乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,并严格按照试剂盒中配套说明书操作。在紫外线分光光度计上,以稀释DNA的缓冲液为对照测定基因组DNA在260 nm和280 nm处的吸光度(A)值,这两处波长的吸光度分别反映碱基中的共轭健和蛋白的含量。当A260/A280为1.7-1.9,判定为DNA样本合格。将提取的DNA样本放于-20 ℃保存、备用。

1.2.1 引物设计与合成 引物设计是通过检索美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共数据库中ATP13A2基因序列,根据引物设计原则并参照相关文献[12]进行设计,确定引物序列后由上海生工公司合成(引物参数见表1)。

表1ATP13A2基因序列PCR引物

Table1PCRprimersforATP13A2gene

位点 引物序列(5′-3′)PCR产物长度(bp)rs56367069F3:TCCATCTGCCTGTCGCTGTA311R3:TGGAGTCCACCCACTCTTCCrs2076603F:ACCCACCATTCAGTCTCCCAT492R:ATTCTGTGCCAATGCCCAACCrs56379718F4:TTCCTACTCCAGCCCCGTT363R4:AAGAGCGGGACCTGCCTAATrs151117874F4:TGCCTCCCCAAATGACCTTTC484R4:CTCACTGCGCTTCTCTAGCCrs147277743F3:CCCACCCACTCTGAGGACTA365R3:CAAGGGCCCAAAAAGATGCC

F:上游引物;R:下游引物

1.2.2 PCR反应条件 反应体系共30 μl:10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,TaKaRa TaqTM Polymerase(5 U/μl)3 μl,DNA模板10-20 ng,加去离子水至30 μl。整个PCR扩增反应在美国ABI公司生产的Verity 96well PCR仪中进行。反应条件为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,65 ℃(-1 ℃/cycle)退火30 s,72 ℃延伸60 s,反复15个循环;95 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,反复20个循环,保存于4 ℃。所得PCR产物加样10 μl于2%琼脂糖凝胶中,以120 V电泳30 min,于紫外光凝胶成像仪下观察,确定所得产物为所需研究片段。5个反应位点反应条件基本相同。

1.2.3 SangerDNA测序 实验中对于判断ATP13A2基因5个位点的突变,我们取PCR所得产物10 μl,送上海生工生物公司与基因组ATP13A2基因标准序列比对,直接测序以确定DNA序列。

1.3 统计学方法

该实验为病例-对照研究,实验数据选用统计软件SPSS 20.0进行分析。年龄为计量资料,若符合正态分布,两组比较采用t检验,若不符合正态,数据用中位数±四分位间距表示，采用Mann-WhitneyU检验。性别及族别为计数资料,采用χ2检验。基因频率和基因型的分布采用基因计数法,基因型资料采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验,计数资料以例数和率(%)表示,两组间相互比较采用χ2检验和(或)Fisher精确概率法。采用Logistic回归分析各位点与帕金森病发病风险的相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

剔除部分DNA质检不合格样本,所得出的一般资料结果见表2。病例组与对照组之间性别、年龄、族别差异无统计学意义(P>0.05)。病例组≤50岁早发性帕金森病(EOPD)27例,>50岁晚发型帕金森病(LOPD)191例。对照组≤50岁33例,>50岁201例。

表2帕金森病例组与对照组一般临床资料的比较

Table2Characteristicsoftheincludedpopulation

组别女/男(例)年龄(岁)汉族/维吾尔族(例)病例组106/11264.00±15.00143/75对照组121/11362.50±16.00144/90χ2/U0.430-1.8330.802P0.512∗0.067#0.371∗

*Pearson Chi-square;#Mann-WhitneyUtest

2.2 Hardy-Weinberg检验

本研究经Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验法检验后,病例组与对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,吻合度良好(见表3)。

2.3 ATP13A2基因多态性分析

ATP13A2基因的五个位点经PCR扩增后为大小不等的片段(见图1)。218例PD患者及234例健康对照组经DNA测序,ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位点基因型均为GG型,未见AG型或AA型突变;rs56379718(Gly49Ser)位点基因型均为CC型,未见CT型或TT型突变;rs151117874(Thr12Met)位点基因型均为GG型,未见AG型或AA型突变。218例PD患者中rs147277743(Ala746Thr)位点基因型仅有1例汉族患者为AG型(见图1A),且该患者为早发型帕金森患者(EOPD);其余217例PD患者基因型均为GG型,未发现有AA型。rs2076603位点基因型有AA、AG、GG三种(见图1B-D),其分布频率见表3。

表3帕金森病例组与对照组基因多态性检测结果例(%)

Table3ResultsofpolymorphismtestbetweenPDgroupandcontrolgroupcases(%)

基因位点n基因型等位基因 GGAGAA GAHWE(P)rs56367069 病例组218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 对照组234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs151117874 病例组218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 对照组234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs147277743 病例组218217(99.54)1(0.46)0(0)435(99.77)1(0.23)0.972923 对照组234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs2076603 病例组21888(40.37)93(42.66)37(16.97)269(61.70)167(38.30)0.15 对照组23472(30.77)109(46.58)53(22.65)253(54.06)215(45.94)0.341rs56379718 CCCTTT CT 病例组218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 对照组234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-

HWE：Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验;-：未能进行检验

图1 ATP13A2基因多态性Figure 1 ATP13A2 gene polymorphism

2.4 维吾尔族、汉族病例组与对照组的ATP13A2基因五个位点的基因型及等位基因的分布

维吾尔族病例组与对照组rs56367069(Arg294Gln)位点、rs56379718(Gly49Ser)位点、rs151117874(Thr12Met)位点、rs147277743(Ala746Thr)位点和rs2076603位点基因型及等位基因分布间差异无统计意义(P>0.05);汉族病例组与对照组rs56367069(Arg294Gln)位点、rs56379718(Gly49Ser)位点、rs151117874(Thr12Met)位点、rs147277743(Ala746Thr)位点基因型及等位基因分布间差异无统计意义(P>0.05)。ATP13A2基因rs2076603位点的基因型GG、AG和AA在汉族PD病例组与对照组中的分布比较,差异具有统计学意义(P<0.05);rs2076603位点的等位基因G和A在两组中的分布比较,差异具有统计意义(P<0.05,见表4)。

2.5 ATP13A2基因rs2076603位点的单因素分析及分层分析

2.5.1 ATP13A2基因rs2076603位点不同基因型遗传模型的单因素Logistic回归及分层分析 在隐性模型中,GG基因型携带者患PD的风险是AG或AA型携带者的0.657倍(P<0.05,见表5)。

2.5.2 ATP13A2基因rs2076603位点的分层分析 根据性别、民族、年龄对Logistic回归进行分层校正:在男性的显性模型中,GG或AG携带者患PD的风险是AA携带者的0.505倍(P<0.05),在男性等位基因模型中,A等位基因是PD的保护因素,携带A等位基因患PD的风险是携带G等位基因者的0.612倍(P<0.05,见表6)。

在汉族隐性模型中,GG携带者患PD是AG和AA携带者的0.522倍(P<0.05),在汉族等位基因模型中,A等位基因是PD的保护因素,携带A等位基因患PD的风险是携带G等位基因者的0.616倍(P<0.05,见表7)。

在大于50岁等位基因模型中,A等位基因是PD的保护因素,携带A等位基因患PD的风险是携带G等位基因者的0.751倍(P<0.05,见表8)。

表4帕金森病例组与对照组基因型及等位基因分布

Table4GenotypicandallelicdistributioninPDgroupandcontrolgroup

位点 组别基因型等位基因GGAGAAχ2PGAχ2Prs56367069 汉族病例组14300-2860-对照组144002880 维吾尔族病例组7500-1500-对照组90001800rs151117874 汉族病例组14300-2860-对照组144002880 维吾尔族病例组7500-1500-对照组90001800rs147277743 汉族病例组142100.49828510.498对照组144002880 维吾尔族病例组7500-1500-对照组90001800rs2076603 汉族病例组5762247.7870.021761108.2110.004对照组376938143145 维吾尔族病例组3131130.1640.92193570.0270.869对照组35401511070rs56379718CCCTTTCT 汉族病例组14300-2860-对照组144002880 维吾尔族病例组7500-1500-对照组90001800

-:未能进行检验

表5两组间ATP13A2基因rs2076603位点基因型不同遗传模型的比较

Table5ComparisonofgeneticmodelsofATP13A2atrs2076603betweenthetwogroups

组别显性模型[(GG+AG)/AA]隐性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例组181/3788/130167/269对照组181/5372/162215/253OR0.6980.6570.731P0.1320.0330.02

表6不同性别中rs2076603位点基因型不同遗传模型的比较(例)

Table6Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinmalesandfemales(cases)

组别女性男性显性模型[(GG+AG)/AA]隐性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)显性模型[(GG+AG)/AA]隐性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例组89/1741/6582/13092/2047/6585/139对照组102/1938/83102/14079/3434/79113/113OR1.0250.7260.8660.5050.5950.612P0.9450.2520.4530.0330.0640.01

表7不同民族中rs2076603位点基因型的不同遗传模型的比较(例)

Table7Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinHanandUgyurpopulation(cases)

组别汉族维吾尔族显性模型[(GG+AG)/AA]隐性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)显性模型[(GG+AG)/AA]隐性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例组119/2457/86110/17662/1331/4457/93对照组106/3837/107145/14375/1535/5570/110OR0.5630.5220.6161.0481.1070.963P0.050.0110.0040.910.750.869

表8不同年龄rs2076603位点的遗传模型(例)

Table8Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsindifferentages(cases)

组别≤50岁>50岁显性[(GG+AG)/AA]隐性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)显性[(GG+AG)/AA]隐性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)病例组24/313/1417/37157/3475/116150/232对照组28/59/2429/37153/4863/138186/216OR0.70.4040.5860.690.7060.751P0.6480.0980.1640.140.1010.048

3 讨论

近年来多项研究均表明ATPl3A2基因是PD的易感致病基因[8-10]。我们通过采用SangerDNA测序方法对新疆地区汉族、维吾尔族帕金森患者进行ATP13A2基因多态性研究。在本研究中我们发现,ATP13A2基因rs2076603位点的基因型GG、AG和AA在汉族PD病例组与对照组中的分布比较,差异具有统计学意义(P<0.05);rs2076603位点的等位基因G和A在两组中的分布比较,差异具有统计意义(P<0.05),提示ATP13A2基因的rs2076603位点与PD的发生有相关性。分层分析中发现,在男性等位基因模型中,A携带者患PD是G携带者的0.612倍(P<0.05);在汉族等位基因模型中,A携带者患PD是G携带者的0.616倍(P<0.05);在大于50岁等位基因模型中,A携带者患PD是G携带者的0.751倍(P<0.05),rs2076603的A等位基因在不同性别、族别、年龄中有显著差异,提示A等位基因可能是PD的保护因素。在218例PD患者中我们发现1例患者rs147277743(Ala746Thr)位点突变,为杂合子基因突变AG,突变频率为0.46%,该患者为46岁女性,为EOPD患者,该患者临床表现以震颤及平衡障碍为主,由于突变样本量少,与野生AA基因型无法做比较,今后的工作仍需扩大样本量继续进一步研究。在我国大陆及台湾有研究结果显示PD存在ATP13A2基因Ala746Thr和Thr12Met位点的突变,但其基因突变总体频率较低[13-19]。我们的研究发现在218名PD病例组及234例对照组均未发现rs56367069(Arg294Gln)位点、rs56379718(Gly49Ser)位点、rs151117874(Thr12Met)位点多态性,与目前研究所报道的ATP13A2基因总体突变频率较低的研究结果一致。

新疆的维吾尔族有着与汉族人种不同的遗传背景[17-18,20],生活方式及饮食习惯也有不同,但是在本文中通过比较ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位点、rs56379718(Gly49Ser)位点、rs151117874(Thr12Met)位点、rs147277743(Ala746Thr)位点和rs2076603位点的基因型和等位基因分布发现,在新疆的维吾尔族与汉族两民族PD患者中差异不明显,维吾尔族病例组及汉族病例组分别与其相应民族的对照组多态位点基因型和等位基因频率分布比较差异亦不明显,提示该基因的多态位点在这两个民族PD患者间可能存在较小的差异性。

大多数PD患者为散发性,但约10%-20%的PD患者具有家族遗传史,遗传因素在PD的发病中起了重要作用,在近些年的报道中,不断发现新的PD致病基因位点,目前关于不同民族的PD易感基因的研究尚不足,我们将在今后的工作中进一步开展大样本、多中心的临床研究进行深入探讨。