百草枯中毒大鼠肺组织中KL-6黏糖蛋白和羟脯胺酸的表达及肺纤维化的变化

张 引,刘 阳,何静春,刘亮亮,刘 斌,赵希洋*

(1武警特色医学中心ICU,天津 300162;2天津市第四中心医院呼吸内科;*通讯作者,E-mail:Lvcaoyiyi1985@163.com)

百草枯是使用较为广泛的快速触杀型除草剂之一[1,2],可致人畜中毒,其中毒机制目前尚不十分明确,因此缺少特异性的解毒剂,中毒病人的死亡率为85%-95%[3,4]。百草枯中毒的早期重症病人一般死于脏器功能衰竭[5,6],而晚期病人则会出现严重的低氧血症,大部分病人死于重度肺纤维化或者其综合征,肺间质纤维化与许多炎性因子及氧化应激具有直接的关系[7,8]。由于肺组织存在多胺摄取体系,能够主动摄取百草枯,因此百草枯对肺组织的损害最为严重,早期百草枯中毒病人多为急性肺损伤,而后期病人则会引发不可逆转的广泛的肺纤维化[9]。以往研究肺腺癌肿瘤标志物时发现,涎液化糖链抗原-6(krebs von den lungen-6,KL-6)黏糖蛋白水平能够快速直接反映肺泡上皮和间质的损伤程度,其机制可能是KL-6黏糖蛋白能够增强成纤维细胞增殖,因此对肺纤维化的发生以及发展产生一定程度影响[10,11]。研究表明KL-6黏糖蛋白与肺纤维化关系密切[12],大鼠腹腔注射百草枯可引发肺纤维化,该病理过程与人类百草枯中毒时肺纤维化的病理过程类似。故本实验采用百草枯制作大鼠肺纤维化模型,观察大鼠肺组织变化及测定肺组织羟脯胺酸(hydroxyproline,HYP)、探讨KL-6糖蛋白在百草枯中毒致急性肺损伤及纤维化组织的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

SPF级8周龄雄性SD大鼠54只,体质量250-280 g(购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心、生产许可证号:SCXK-(军)2007-004)。百草枯购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。KL-6黏糖蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,羟脯氨酸含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,硫代巴比妥酸法MDA检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司,硫代巴比妥酸法SOD检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 建模、分组及提取标本

将54只大鼠适应性饲养1周后,使用随机数字法分为百草枯模型组(n=27)和对照组(n=27)。百草枯模型组以0.4%百草枯稀释溶液按照14 mg/kg的剂量行腹腔注射[13],对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水,分别于给药后第7,14,28天处死前(每组9只大鼠)测量体质量,观察大鼠精神状态;摘除大鼠左肺;置-80 ℃冻存，测定大鼠的肺组织HYP含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

1.3 肺泡炎症、肺纤维化程度判断

大鼠肺组织石蜡切片HE染色,在光学显微镜下观察肺组织病理学改变。根据Szapiel等[15]的方法评价肺组织病理改变:无肺泡炎症或者无纤维化、且肺组织的受累面积为0时,标记为“-”;轻度肺泡炎症或者纤维化、而且肺组织的受累面积<20%时,标记为“+”;中度肺泡炎症或者纤维化、而且肺组织的受累面积为20%-50%时,标记为“++”;重度肺泡炎症或者纤维化、而且肺组织的受累面积>50%时,标记为“+++”。

1.4 肺系数测定

大鼠建模成功后,在第7,14,28天时将大鼠颈锥脱臼处死、开胸取肺,用滤纸将肺表面的血水吸取干净,用电子天平称重,计算肺系数,肺系数=(大鼠的湿肺质量÷大鼠体质量)×100。

1.5 酸水解法测定肺组织HYP含量

大鼠肺组织研磨均浆,加6 mol/L氯化钾溶液1 ml,130 ℃水解5 h，调节pH值6.5-7.0,加双蒸水30 ml和0.05 mol/L的氯胺1.0 ml摇匀,室温反应20 min,用ELISA法检测HYP含量,按照HYP含量测定试剂盒说明书操作,取分光光度计在550 nm处测量吸光度值,计算羟HYP含量。

1.6 肺组织MDA含量和SOD活性测定

大鼠的肺组织研磨匀浆,4 000 r/min离心10 min,提取上清液2 ml,加0.6%TBA溶液2 ml,沸水浴15 min。利用硫代巴比妥酸法,按照MDA检测试剂盒和SOD检测试剂盒说明书操作,取上清液在532 nm和450 nm的波长处测量吸光度值。

1.7 肺组织KL-6黏糖蛋白含量测定

造模后第7天、第14天和第28天,通过尾静脉采集外周血3 ml,置3.2%枸橼酸钠抗凝管,4 ℃保存,用ELISA测定KL-6定量,按照试剂盒说明书操作,使用酶标仪在450 nm处检测吸光值,计算KL-6浓度。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 体质量及精神状态

在三个不同时点检测结果显示,对照组大鼠体质量增加、精神状况较好;而百草枯模型组大鼠的体质量先下降,在第28天时开始回升,但与同期对照组比较体质量仍较轻,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。百草枯组大鼠给药第7天时,精神萎靡、精神不振、进食变少、活动量降低、呼吸急促、口鼻有血性分泌物,第28天时精神转好、活动量和体质量增加。

2.2 两组大鼠染毒后的肺组织水肿情况

百草枯模型组大鼠中毒第7天时,大鼠的肺组织出现水肿,肺泡间隔开始变宽,肺泡腔内有渗出,肺毛细管扩张充血,可见中性粒细胞以及单核巨噬细胞浸润;中毒后第14天,肺组织的充血情况减少,部分肺叶少量瘀血,肺部肿胀变轻,肺内的炎性细胞集中,胶原纤维增多;中毒后第28天时,肺泡结构变宽、塌陷,炎性浸润减轻,胶原纤维以及纤维细胞出现(见图2)。

图1 实验不同时间点两组大鼠体质量变化Figure 1 Changes of body mass of rats in two groups at different time points

图2 两组大鼠染毒后的肺组织水肿情况 (免疫组化SP法,×400) Figure 2 Pulmonary edema after exposure in two groups (immunohistochemical SP method,×400)

2.3 两组大鼠染毒后的肺系数变化

百草枯模型组大鼠随着染毒时间延长,其肺系数明显增加,在第14天时达到最大值,之后其肺系数开始降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图3),提示百草枯组大鼠在中毒后第14天时肺水肿。

2.4 肺组织HYP含量

百草枯模型组大鼠随着染毒时间的延长,肺组织HYP含量增多,与同期对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

2.5 肺组织SOD活性及MDA含量

百草枯组大鼠随着染毒时间的延长,肺组织中SOD的活性增加,到第28天时SOD含量表达最强;肺组织中MDA含量降低,至第28天时其含量表达最低,差异有统计学意义(P<0.05,见图5)。

2.6 KL-6在大鼠肺组织内的含量

百草枯大鼠随着染毒时间的延长,肺组织中KL-6的表达增加,到第28天时肺组织内的KL-6含量表达最强,差异有统计学意义(P<0.05,见图6)。

图3 两组大鼠肺系数的变化Figure 3 The changes of lung coefficients in the two groups

图4 两组大鼠HYP的含量Figure 4 Contents of HYP in rats in two groups

图5 两组大鼠肺组织SOD活性和MDA含量的比较Figure 5 Changes of SOD activity and MDA content in lung tissues of rats at different time points in two groups

图6 各组大鼠肺组织KL-6平均光密度值Figure 6 Average optical density of KL-6 in lung tissue of rats in each group

3 讨论

我国是目前百草枯最大的生产国以及最大的使用国[14,16]。百草枯中毒的病死率大约为85%-95%,幸存者亦存在肺纤维化,预后的效果不理想[17]。百草枯中度的中毒病人在染毒后的1 d内会很快出现急性肺损伤的特征,然后就会转为急性呼吸窘迫综合征,如果第7天时病人仍然为存活的状态,其肺部损伤就会出现逐渐加重的状况,从而发展为不可逆的肺间质纤维化,后期的病人一般死于呼吸衰竭。羟脯氨酸是胶原纤维所具有的特征物。而肺纤维化的前提是胶原纤维,故通过对羟脯氨酸含量进行检测,从而能够对胶原含量进行间接反映,能够将其作为检测胶原代谢的重要因素。KL-6是一类肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的大分子唾液酸糖蛋白，大部分于肺泡Ⅱ型上皮细胞表面表达，有佷少部分的表达在正常肺部组织以及终末细支气管肺泡上皮细胞表面，而其在肺泡Ⅰ型上皮细胞上并不表达[18]。肺间质性病变病人血清中KL-6黏蛋白的水平与其他呼吸系统疾病病人进行对比,其KL-6黏蛋白的水平出现明显升高[19]。日本研究学者的研究结果表明血清中的KL-6黏蛋白水平比500 U/ml高,是结缔组织病并发间质性肺疾病的特征。此外,活动期间质性肺病病人与非活动期间质性肺病病人进行对比发现,在活动期间质性肺病病人的血清中KL-6黏蛋白的水平含量出现明显升高,而浓度较高的血清中的KL-6黏蛋白水平与迅速进展致间质性肺病具有直接的关系。因此,KL-6黏蛋白水平对于研究这类疾病具有很大价值[20],KL-6黏蛋白水平的数值变化能够直接对肺病疾病状态进行反映。此外,百草枯中毒后肺组织中SOD的活性增加,且肺组织内的SOD含量表达增强。这表明百草枯中毒早期以氧化还原损伤的急性炎性渗出损伤为主。而且,本研究发现肺组织形态、肺系数、MDA、SOD、KL-6与肺纤维化的关系均较密切,故而检测百草枯中毒患者血清SOD、MDA和KL-6黏蛋白水平对判断中毒程度、指导治疗及评估预后有其意义。

综上所述,KL-6黏蛋白参与着肺纤维化的全部发展过程。关于KL-6黏蛋白的测定存在十分重要的临床意义,这能够对肺纤维化的初始、发展以及其严重程度进行指导作用,进而对其相关治疗以及判断预后制定有价值的治疗方案。