张 帆,贾 昕,姚 红,逯晓青,郭 超,杨晓峰
(1山西医科大学微生物学与免疫学教研室,太原 030001;2山西医科大学第一医院泌尿外科;*通讯作者,E-mail:yxfylq@163.com)
乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常见的恶性肿瘤,其病死率居于女性肿瘤之首。我国乳腺癌患者死亡率高于国外患者,但治愈率较低,严重威胁着女性的生命健康,近年来乳腺癌靶向药物显著提高了患者治疗效果[1]。目前迫切需要研发新的诊断和治疗手段以提高乳腺癌患者的治愈率和降低死亡率。而寻找无创、敏感性高、特异性强且简单可行的肿瘤标志物作为乳腺癌的早期诊断和治疗工具将具有重要的临床应用价值。
噬菌体展示技术是一种将多肽或蛋白展示在噬菌体衣壳蛋白表面,并能将所需的多肽或蛋白从含有大量变异体的集落中分离出来的实验技术。十几年来,国内外的研究人员利用噬菌体展示技术针对不同的肿瘤进行筛选,发现了多种肿瘤靶向肽,这些靶向肽对肿瘤细胞及其微环境例如肿瘤血管有亲和力[2]。这些特异性多肽既可以作为体内肿瘤成像剂,用于肿瘤及其微转移灶的早期诊断;也可用于连接抗癌药物进行靶向治疗,而不损伤其他健康组织。Bcap-37细胞属于浸润性乳腺髓样癌细胞,通过国内外献检索尚未发现利用噬菌体展示技术筛选人Bcap-37细胞靶向肽的研究,本研究利用噬菌体展示技术筛选人乳腺癌细胞特异性结合小肽,为乳腺癌早期诊断的治疗提供新的靶点。
人乳腺髓样癌Bcap-37细胞、人正常乳腺上皮细胞MCF-10A购自上海奥陆生物科技有限公司。噬菌体展示七肽库试剂盒(Ph.D.TM-7 Phage Display Peptide Library Kit)购自New English Biolabs(NEB)公司。M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒(M13 Isolation Kit)购自美国Biomiga公司。辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(HRP/Anti-M13)购自美国GE Healthcare公司。IPTG、Xgal、PEG购自武汉博士德生物工程有限公司。
将人乳腺髓样癌Bcap-37细胞及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A培养于DMEM高糖培养基中(含10%胎牛血清),37 ℃、5% CO2培养。将两种细胞悬液置于经过多聚赖氨酸处理的细胞培养皿中,在人乳腺癌Bcap-37细胞加入1%牛血清白蛋白(BSA)BSA 37 ℃孵育1 h时,加入Ph.D.TM- 7原始噬菌体展示七肽库原液(滴度为2×1011pfu/ml),37 ℃孵育1 h,用0.05% TBST洗涤5次去除未与细胞结合的噬菌体,加入0.2 mol/L甘氨酸洗脱液1 ml,将结合噬菌体洗脱下来。将洗脱液加入到已经封闭好的人正常乳腺上皮MCF-10细胞培养皿中,室温下作用1 h,上清液即为第一轮筛选得到的噬菌体,PEG法提纯,进入下一轮筛选。噬菌体展示肽库体外减性筛选条件,肽库与人乳腺癌Bcap-37细胞结合时间分别减少到45 min(第2轮)、30 min(第3轮)和20 min(第4轮);洗脱液与人正常乳腺上皮MCF-10A细胞吸附时间增加到75 min(第2轮)、90 min(第3轮)和105 min(第4轮);把第4轮筛选所得的噬菌体液接种LB/IPTG/Xgal琼脂平板,随机挑选蓝色阳性噬菌体克隆大量扩增提纯。
从LB/IPTG/Xgal琼脂平板随机挑取的20个单克隆噬菌体进行特异性检测,将人乳腺癌Bcap-37细胞及正常乳腺上皮MCF-10A细胞以2×104/孔的密度铺于96孔板,PBS做空白对照(每组设2个复孔)。PBS冲洗细胞,加入50 μl 0.25%戊二醛溶液固定细胞15 min。加入100 μl 3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性。用5% PBS-BSA 37 ℃封闭60 min。每孔分别加入1×1010pfu单克隆噬菌体,37 ℃孵育1.5 h。PBS冲洗5次,加入HRP/Anti-M13抗体(100 μl/孔),37 ℃作用1 h,加入TMB显色液,待液体变蓝后,全自动酶标仪检测450 nm处的OD值。将人乳腺癌Bcap-37细胞OD值设为S、正常乳腺上皮MCF-10细胞OD值设为P,采用公式为:S/P(S及P值均是相应的OD值减去PBS空白对照的OD值之后的值),若比值大于2.5即为阳性结果。
将阳性噬菌体克隆用M13噬菌体单链DNA提取试剂盒提取核酸,使用噬菌体肽库试剂盒自带-96gⅢ测序引物:5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′,由上海英潍捷基贸易有限公司测序。登陆NCBI-BLAST网站对筛选的多肽序列与目前数据库中已知蛋白质的氨基酸序列进行同源性分析。
以人乳腺髓样癌Bcap-37细胞为靶细胞,人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为吸附细胞,使用噬菌体展示随机七肽库,进行4轮减性筛选。结果显示,噬菌体滴度由第1轮的4.0×104增加到第4轮的3.2×107(见图1);同时回收得率也由第1轮的2.0×10-7增加至第4轮的1.6×10-4,提高了约800倍(见表1)。表明与人乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的噬菌体逐渐增加,到第4轮出现明显富集。
A. 第1轮筛选后噬菌体滴度测定 B. 第4轮筛选后噬菌体滴度测定图1 噬菌体滴度测定Figure 1 Phage titer determination
表1噬菌体展示肽库体外筛选后噬菌体克隆富集
Table1EnrichmentofphageclonesfromPhageDisplayPeptidesLibrarybyinvitroscreening
筛选轮数投入噬菌体量(pfu)回收噬菌体量(pfu)回收率12×10114.0×1042.0×10-722×10111.8×1069.0×10-632×10111.4×1077.0×10-542×10113.2×1071.6×10-4
回收率=洗脱回收的噬菌体量/投入的噬菌体量
随机挑取20个单克隆噬菌体蓝斑,利用ELISA法鉴定单克隆噬菌体对人乳腺癌Bcap-37细胞的亲和力。结果显示,1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20号噬菌体Bcap-37细胞的OD450 nm值显著高于MCF-10A细胞,S/P比值大于2.5,为阳性噬菌体克隆(见图2)。
图2 ELISA检测单克隆噬菌体亲和力Figure 2 The affinity of monoclone phage by ELISA
挑取20个阳性的噬菌体克隆进行DNA提取并测序(见图3),得到外源性七肽插入的碱基序列,并翻译出对应的氨基酸序列。结果显示,重复率最高的噬菌体克隆的多肽序列为LXRNTNX(13/20),其次为SAGFRIX(5/20)及LPPMNSX(2/20);LXRNTNX即为本研究筛选所得的七肽序列。氨基酸序列的同源性分析结果显示,该序列与数据库中已知基因和蛋白无同源性,且国内外文献均未见报道。
图3 阳性单克隆噬菌体基因测序图Figure 3 Gene sequencing map of positive monoclonal phage
1985年Smith等[3]成功创立了噬菌体展示技术,1990年Scott等[4]在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。通过肽库技术筛选的多肽分子具有较好的靶向特异性,因而成为目前癌症诊疗中最具有潜力的方法之一。研究表明针对黑色素瘤、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌及鳞状细胞癌等特定肿瘤有特异亲和力的肽已被筛选出[5,6]。
噬菌体展示技术体外生物淘选(也常称全细胞淘选)用于分离与细胞特定靶点连接的多肽,也就是将培养的完整细胞作为诱饵以达到分离各种细胞连接多肽的淘选方法。Liu等[7]利用噬菌体展示体外差减筛选方法,得到人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的靶向12肽序列GYSASRSTIPGK。Bcap-37细胞属于浸润性乳腺髓样癌细胞,是一种特殊的组织学类型,一般分化较低,预后不佳[8]。但根据国内外文献目前尚无筛选Bcap-37细胞靶向肽的报道。
本研究使用全细胞体外差减筛选方法对噬菌体随机七肽库与乳腺癌Bcap-37细胞进行了4轮筛选。随着筛选次数获得的噬菌体量逐渐提高,回收率也逐轮递增,说明与乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的噬菌体得到了富集。随机的选取20个生长良好的单克隆噬菌体斑,通过ELISA法鉴定其亲和力。经对阳性单克隆噬菌体进行序列测定,得到的短肽LXRNTNX。本实验成功筛选获得了人乳腺髓样癌Bcap-37细胞的靶向多肽分子,在今后的研究中将通过体内外实验验证短肽LXRNTNX对人乳腺癌细胞的特异性及亲和力。本研究结果为乳腺癌早期诊断和靶向治疗提供了可能的潜在靶点。