鱼肉肌红蛋白的呈色机理及其在热加工中对肉色的影响

1.浙江国际海运职业技术学院 浙江舟山 316021 2.浙江工商大学水产品加工研究所 浙江杭州 310035 3.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 浙江杭州 310035

水产品是人们日常饮食中不可缺少的重要部分，尤其是鱼类，由于肉质鲜嫩，营养丰富，深受消费者的喜爱。鱼肉的颜色是评价鱼肉品质的重要指标之一。肉及肉制品颜色的变化是一个较为复杂的话题，包括了众多的影响因素，比如肉的来源，屠宰前和屠宰时的条件，肌肉的理化成分以及肉品的加工、包装、物流、贮藏和消费条件。原因不尽相同，但归根结底的基本影响因素始终为肌肉中呈色物质—血红素蛋白质的变化[1]。

鱼肉中的血红素蛋白质包括肌红蛋白和血红蛋白，其中，血红蛋白主要分布在鱼的内脏和血管中，在加工贮藏中易流失；肌红蛋白分布在肌肉细胞中，是鱼肉(尤其是金枪鱼属和一些暗色肉鱼类)的主要呈色物质，据报道[2]，黄鳍金枪鱼暗色肉中的Mb含量为5.3～24.4mg/g，而其血液中的Hb含量也只为0.5～3.8mg/g，故肌红蛋白的变化直接影响肉色的变化。肌红蛋白的化学状态受诸多因素影响，如温度、pH值、脂肪氧化、氧分压、离子强度等[3]。

除了生鲜、冷冻鱼的消费，部分鱼肉加工成半成品、熟制品进行销售流通，如柴鱼、蒸煮后进行软包装的鱼片、鱼柳，鱼肉罐头等。在一些热加工中，鱼肉颜色会发生较大的变化。

本文通过阐述肌红蛋白的基本理化性质、呈色机理和常用检测方法，对影响肌红蛋白氧化的因素、肌红蛋白在热加工中所引起的肉色变化及其原因进行了分析和讨论，旨在为鱼肉热加工中的护色工艺提供参考依据。

1 肌红蛋白的理化性质及呈色原理

1.1 肌红蛋白

肌红蛋白(Myoglobin，Mb)是一种存在于动物肌肉组织细胞中的球状蛋白质，相对分子量为15 000～17 000Da，由一条多肽(球蛋白，Globin)和一个血红素(Heme，Hemin)构成，为水溶性蛋白质。Mb在不同条件下具有多种结构，其中脱氧肌红蛋白(Deomyoglobin，DeoMb)、氧合肌红蛋白(Oxymyoglobin，OxyMb)和高铁肌红蛋白(Metmyoglobin，MetMb)为常见的三种衍生物。

图a为脱氧肌红蛋白结构；图b为氧合肌红蛋白结构；图c为高铁肌红蛋白结构图1 三种肌红蛋白衍生物的结构Fig. 1 The structure of myoglobin and the different coordination on porphyrin ring

血红素是卟啉环与铁原子的络合物，是肌红蛋白呈色的关键结构(图1)。中心铁原子具有六个配位键，通常形成一个正八面体，其中四个与卟啉环的四个吡咯环氮配位，第五位与多肽链中组氨酸的咪唑基配位，第六配位键根据配合物的不同分别形成脱氧肌红蛋白、高铁肌红蛋白(与水分子结合，图1a、图1c)和氧合肌红蛋白(与氧分子结合，图1b)。DeoMb和OxyMb中的铁原子为还原态(II)，血红素称为亚铁血红素(Heme)；MetMb中的铁原子为氧化态(III)，相应的血红素称为高铁血红素(Hemin)。

1.2 肌红蛋白的呈色原理

肌肉颜色的变化与Mb的化学状态是紧密相关的。图2显示了各种肌红蛋白衍生物之间的相互转变。在活鱼或刚翻肚皮鱼的肌肉中，Mb主要以还原态(II)的形式存在，鱼肉呈鲜红色(粉红色)或深紫色(高浓度DeoMb呈深紫色，常见于大型鱼体的深层鱼肉中)。其中，OxyMb和DeoMb会发生相互转变，DeoMb转变OxyMb的过程称为氧合氧化。鱼死后，在贮藏过程中，Mb(II)则逐渐转变为MetMb(III)，使鱼肉呈褐色，这个过程为血红素蛋白质的自动氧化(Autoxidation)。这种颜色的变化，可通过Mb各种衍生物特有的吸收光谱进行测定。另外，Mb的自动氧化还会产生一些超氧阴离子自由基(O2·-和·OOH)，这些物质会进一步歧化生成H2O2[4]。MetMb在H2O2等过氧化物的作用下进一步氧化，生成具有极强促氧化能力的超铁肌红蛋白自由基(Perferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)和超铁肌红蛋白(Ferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)。但这种肌红蛋白(Fe IV)由于生成量极少且性质活泼不稳定，容易发生自动还原生成MetMb[5]。

图2 各种肌红蛋白衍生物之间的相互转变Fig. 2 Dynamic Conversion between the different myoglobin

鱼在贮藏加工中，大量的OxyMb转变为MetMb，肉色逐渐褐变。研究表明[6,7]MetMb的结构比OxyMb不稳定，血红素与肽链的结合力远弱于OxyMb[8]，故其卟啉环更易发生裂解而造成血红素和铁离子的丢失，这是在保藏期长或者一些加工程度高的鱼肉中出现褪色现象的原因之一。

2 鱼肉Mb常用检测方法

根据鱼种类和肌肉类型的不同，肌红蛋白易在贮藏和加工期间易发生变化或流失，故检测Mb含量对评价肉色有重要作用。DeoMb、OxyMb、MetMb在紫外可见区域都具有特征吸收光谱，鱼类的Mb在可见光波长内的吸收光谱基本相同，在410nm附近有强吸收峰，在500～750nm范围具有若干个弱吸收峰。根据Mb的特征吸收光谱，可应用朗伯-比尔定律(A=εbc)来测定Mb的含量，但不同来源的Mb吸收光谱有所差异。根据前人的研究[9～12]，几乎所有的计算公式(计算禽畜和鱼类等动物肌肉中的MB含量)是基于马Mb的消光系数，大多采用其近似公式，故有一定的局限性。

由于不同Mb衍生物的颜色不同，Mb含量及三种衍生物的比例，尤其是MetMb的比例对鱼肉颜色有较大的影响，故三种Mb衍生物发的百分含量可作为肉色的判断标准之一。近些年涉及Mb衍生物含量测定的研究中，应用较多的是以马心Mb的吸收光谱为基础所建立的计算方程[12]。Matsuura(1955)[13]和Brown(1962)[14]等人报道大目金枪鱼和蓝鳍金枪鱼的Mb衍生物具有相同的最大吸收波长和最小吸收波长，并比较了几种鱼类Mb的吸收光谱。Chotika(2011)等人[15]以大眼金枪鱼三种Mb衍生物的吸收光谱为基础，建立了金枪鱼Mb浓度的计算方程，该方程在一些鱼类肉色和鱼类Mb的研究中应用较多，其它鱼类的计算方法还未被明确报道过。

近期，张同刚(2018)等人[16]报道采用于拉曼光谱法来无损检测冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量，并得到相关的推导公式，具有一定的可行性。该方法在鱼类Mb相对含量的检测应用上还未见报道。

3 影响Mb稳定性的因素

鱼肉在加工贮藏中，肉色主要由Mb的性质决定，Mb稳定性的影响因素包括Mb的溶解度，热稳定性、自动氧化性质及促氧化因素、高铁肌红蛋白还原酶系等。

3.1 Mb的溶解度

Mb是水溶性蛋白质，研究表明即使反复多次用水抽提暗色肉的Mb，也不能使鱼肉完全脱色，这是由于稳定的肌原纤维蛋白质在机械操作下发生变性，包裹住了Mb，以致其难于溶出[17]。所以大部分鱼肉在加工中，无法消除因Mb变化所引起的肉色变化。

3.2 Mb的热稳定性

Mb稳定性因鱼的种类和衍生物类型而异，一般鱼类Mb比哺乳动物类Mb的热稳定性差，尤其是MetMb，容易发生热变性。此外，Ledward(1971)[18]等人已经证实Mb在肌肉中的热稳定性比在其肌肉相同pH值和离子强度的溶液中的热稳定性要低得多。但沙丁鱼的MetMb在某些条件下，对热是极其稳定的，这在沙丁鱼的加工上是值得注意的。

3.3 Mb的自动氧化性质及促氧化因素

鱼类Mb的自动氧化速度比其他来源的Mb快得多，比如同一条件下是哺乳类动物Mb氧化速度的2.5～4倍。Mb氧化一般发生在Mb结构中的血红素铁部分，珠蛋白部分几乎不发生同步氧化。低pH值，高盐浓度、非血红素铁[19]、脂质氧化[20～22]等因素都能明显促进Mb的氧化。此外，有较多研究[23～25]证明脂质氧化和Mb氧化存在密切联系，脂质氧化产生的初、次级代谢产物具有促进Mb氧化的作用[26,27]，进而加速肉色褐变或褪色。此外，脂质氧化对不同来源的Mb的促氧化作用有所差异[28]。

3.4 高铁肌红蛋白还原酶系

在活体鱼的血红细胞中存在高铁肌红蛋白还原酶系(MetMb还原酶系)，能不断将MetMb还原，使其维持在2%～3%左右[29]。近年来关于MetMb还原酶对肉色稳定性作用的研究中，由于Mb的来源不同，实验方法有差异，两者的相关性还存在一些争议[2]。松浦等人(1962)[30]认为蓝鳍金枪鱼中的MetMb还原酶与其肉色稳定性呈正相关，且是维持鱼肉鲜红色的主要原因。肌肉中存在丰富的毛细血管，其中残留的还原酶就延缓了肉色的褐变。不过，随着时间的延长和加热温度的升高，还原酶系的活性将会逐渐减弱，直至完全消失。

4 热加工中Mb及肉色的变化

加热后的鱼肉会呈现出白、粉红、红、暗褐色等各种颜色。一些Mb含量较少的鱼加热后一般呈白色、浅粉红色或浅褐色，Mb含量较高的红肉鱼(鲐鱼、金枪鱼、鲣鱼、秋刀鱼、鲭鱼、沙丁鱼等)则多呈红或暗褐色。热处理使Mb的珠蛋白变性，也使原本与血红素铁第六配位键结合的水分子被肉中微量的尼克酰胺等碱基所取代，此时血红素转变为血色原(Hemochrome,Fe2+)。小泉[31]以金枪鱼鱼肉的Mb为原料进行了研究，认为金枪鱼中尼克酰胺含量量相对较少，还不够使全部的Mb变为血色原。当加热温度较低或加热时间较短时，Mb几乎不变性，若鱼肉中尼克酰胺等碱基的含量较高，Mb则大部分变为血色原，使肉的颜色变为红色或粉红色。当鱼肉中尼克酰胺等碱基含量较低时，生成的血色原不稳定，立刻被氧化成高铁血色原(Hemichrome，Fe3+)，使肉呈现棕褐色。此外，Ledward(1971)[18]认为在低于Mb热变性的温度下，Mb也会发生构象的改变，使结构中的血红素暴露，并与其它已产生变性的蛋白质结合。比如，侧链带有咪唑基团的变性蛋白质会与血红素中的铁原子发生螯合并最终取代珠蛋白，所以他认为熟肉中的肌红蛋白是一些血红素和几种蛋白质相结合的混合物。

Mb的氧化还原状态会也影响鱼肉加热后的颜色。一般来说，DeoMb比OxyMb和MetMb具有更好的热稳定性[32]。当鱼肉的MetMb含量较高时，加热后高铁血色原所占比例高，肉呈暗褐色。研究表明[33]，当牛肉中OxyMb和MetMb比例较高时，加热后更容易提前出现进一步的褐变(相比于DeoMb比例较高的牛肉)；提高加热温度和延长加热时间会降低牛肉的红度值[34]。该研究结果这对Mb含量较高的红肉鱼的热加工有一定的借鉴作用。

有研究[25]指出脂质氧化的初级代谢产物(过氧化物)能加速Mb结构中卟啉环的裂解。加热能加速脂质氧化及降低Mb结构的稳定性，使蒸煮鲣鱼在贮存过程中发生严重的褪色现象[35]。

前文提到MetMb还原酶系能有效降低MetMb的含量，该酶在50℃左右就失去活性了[32]，但肌肉中存在着一个NADH-MetMb减少系统，即使是在60℃左右这样的高温下，也能使MetMb产生类似于OxyMb的鲜红色[36]。当肉的pH值较低且加热温度相对较低时，已变性Mb中的铁离子很可能还保持2价状态，从而呈现粉色或红色，而不是常见的灰色或棕褐色[37]。

肉类的包装方式对加热后的颜色变化也有重要影响。Torngren(2003)[38]发现将采用高浓度氧气MAP包装的牛排加热时，其表示熟肉的棕褐色会提前出现。而一氧化碳MAP包装的肉类在加热时更能保持肉原有的粉红色[39]，这是由于CO-Mb的热稳定性较高(高于DeoMb)。John(2004)和Seyfert(2004)等人[40～42]对MAP包装气体比例含量等因素对肉类加热后颜色变化的影响进行了研究。

此外，其他一些因素也会影响加热后的肉色。比如长鳍金枪鱼罐头中的肉一般呈粉红色，但当原料肉中含有较多的氧化三甲胺时，蒸煮后的肉容易呈现青绿色。

综上所述，热处理后Mb结构的变化与肉色有密切联系，原料种类(尼克酰胺等碱基的含量)、原料的新鲜度(MetMb与变性Mb的比例)、脂质氧化引起的Mb结构变化等因素对加热后的肉色有重要影响，此外加热温度、pH值、包装方式、氧化产物等其他因素在鱼肉热加工中应予以考虑。

5 小结

鱼肉热加工重要的是鱼肉肌红蛋白含量较一般的畜肉类低，但在鱼肉的加工贮藏中，Mb的变化也会引起肉色较大的改变。加热是一种较常见传统的肉品加工方式，热处理后Mb结构的变化与肉色有密切联系，鱼肉种类、原料的新鲜度、脂质氧化程度、加热温度、pH值、包装方式、氧化产物等其他因素对加热后的肉色有重要影响。故要根据鱼肉肌红蛋白的特性，以及产品加工及贮藏方式的特点，充分考虑热加工中肌红蛋白变化引起的感官品质变化，合理改进加工工艺条件，以尽量降低由肌红蛋白改变引起的质量下降。