miRNA-138模拟物转染对人乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响及其机制

董超，黄远丽，徐正丰

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院，湖北荆州 434020)

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，我国是乳腺癌的高发区，每年新发病例数占全球新发病例的12.2%，死亡病例占全球乳腺癌死亡病例的9.6%，并且呈年轻化趋势[1]。肿瘤的侵袭、转移是患者致死的最重要原因之一，乳腺癌的侵袭、转移是一个多基因参与，通过多步骤完成的复杂的过程，但其具体机制目前尚不清楚。微小RNA-138(miRNA-138)是家族重要成员之一，其在多种恶性肿瘤中呈低表达，在肿瘤的发生、侵袭及转移过程中起重要的调控作用[2]。但至今，有关miRNA-138在乳腺癌中的研究甚少，并且miRNA-138对乳腺癌侵袭及迁移的作用及其机制尚不明确。本研究观察了miRNA-138模拟物(miRNA-138 mimics)对人乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、miRNA-138模拟物及主要试剂 人高侵袭性乳腺细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468及人低侵袭性乳腺癌细胞系MCF-7[3]和人正常乳腺上皮细胞系HBL-100均购自美国ATCC细胞库。miRNA-138模拟物(miRNA-138 mimics)及miR阴性对照模拟物(miR-NC)均购自上海吉玛制药技术公司。RPMI1640培养基、Transwell小室购自购自美国Corning公司，TRIzol试剂购自北京达科为生物公司，miRNA-138、U6引物购自广州锐博生物公司，RNA逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自美国Bio-Rad公司，Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，基质胶购自美国BD公司，一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin和GAPDH均购自美国CST公司，二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138检测 将MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100培养于含10%胎牛血清的RPMI1460培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计鉴定总RNA符合实验要求，取100 ng总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反应体系及反应参数，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40个循环。miRNA-138引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作为内参基因，以2-ΔΔCt代表miRNA-138相对表达水平。

1.3 miRNA-138模拟物转染及细胞分组 MDA-MB-231置入含10%胎牛血清的RPMI1460培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染前24 h，取生长情况良好的对数生长期细胞系接种于6孔细胞板，细胞融合度达70%～80%时采用Lipofectamine2000进行脂质体转染，按照按试剂说明书，分别将miRNA-138 mimics(miRNA-138 mimics组)和miR-NC(miR-NC组)转染至细胞中。转染后继续培养24 h，后收集细胞进行后续实验。

1.4 转染后的MDA-MB-231细胞miRNA-138检测方法 采用qRT-PCR法。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计鉴定总RNA符合实验要求，取100 ng总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反应体系及反应参数，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40个循环。miRNA-138 引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′,5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作为内参基因，miRNA-138相对表达水平应用2-ΔΔCt法计算。

1.5 转染后的MDA-MB-231细胞侵袭和迁移细胞数测算 采用Transwell迁移及侵袭实验。收集转染24 h后的两组MDA-MB-231细胞，用无血清DMEM培养基将两组细胞重悬成为1×105个细胞/mL的细胞悬液，对细胞预先饥饿处理24 h。Transwell小室置于24孔细胞培养板内，小室底膜上室面均匀基质胶包被，Transwell小室上室加入200 μL两组细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基,常规培养24 h。取出Transwell小室，棉签轻柔拭去上室面残留细胞，4%多聚甲醛固定细胞30 min，染色。倒置显微镜下随机选择5个不重复的视野拍照并计数穿膜到下室面的细胞数目。进行Transwell侵袭实验时，小室底膜的上室面不包被基质胶，其他操作与Transwell迁移实验相同。

1.6 转染后的MDA-MB-231细胞SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白检测 采用Western blotting法。取转染后24 h的两组细胞，抽取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每孔取30 μg总蛋白上样，经10%SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭液摇床封闭1 h后，加入一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin 和GAPDH，次日洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL显影液显影，以GAPDH作为对照，条带灰度值采用Quality One分析。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞系中miRNA-138相对表达量比较 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138相对表达量分别为0.23±0.08、0.42±0.05、0.56±0.11、1.03±0.04，MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7与HBL-100比较，MDA-MB-231、MDA-MB-468与MCF-7比较，P均<0.05。

2.2 两组细胞系miRNA-138表达比较 miRNA-138 mimics组和miR-NC组miRNA-138相对表达量分别为13.35±0.35、0.98±0.05，两组比较，P<0.05。

2.3 两组细胞系迁移细胞数、侵袭细胞数比较 结果见表1。

表1 两组细胞系迁移细胞数、侵袭细胞数比较(个，

注：与miR-NC组比较，*P<0.05。

2.4 两组细胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比较 结果见表2。

表2 两组细胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比较

注：与miR-NC组比较，*P<0.05。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐年上升的趋势，严重危害人民健康和生命。目前，临床上主要采用手术、化疗、放疗及内分泌治疗等综合手段治疗乳腺癌，虽然随着医疗技术的发展，乳腺癌的诊疗技术得到不断发展，但过去5年里乳腺癌的总生存率并没有得到实质性提高[4]。乳腺癌的发生进展机制涉及多种信号通路异常和基因突变，目前尚未完全清楚。乳腺癌细胞系MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的，该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因，是被研究者广泛应用的一种高侵袭性乳腺癌细胞模型[3]。

miRNA是近年来发现的一类约22个核苷酸长度的非编码小分子单链RNA，通过降解靶基因mRNA或者抑制其翻译，调控着人体约1/3基因的表达，参与多种疾病的发生发展过程，尤其在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭迁移等生物学过程中发挥着重要的作用[5]。miRNA-138是近年来发现的肿瘤相关的miRNA分子成员之一。研究发现，miRNA-138在前列腺癌[6]、非小细胞肺癌[7]、食管鳞状细胞癌[8]、宫颈癌[9]等多种恶性肿瘤中表达降低，作为抑癌基因抑制肿瘤细胞的侵袭与迁移。至今有关miRNA-138在乳腺癌中研究甚少。本研究显示，miRNA-138在人乳腺癌细胞中的表达水平较人乳腺上皮细胞明显降低，这说明miRNA-138在乳腺癌中也起着抑癌基因的作用，与miRNA-138在其他恶性肿瘤中的研究结果一致。进一步我们发现，miRNA-138在高侵袭性乳腺细胞中的表达较低侵袭性乳腺癌细胞明显减低，提示miRNA-138可能与乳腺癌细胞的侵袭转移能力有关。

侵袭、转移是恶性肿瘤的重要的生物学特征，为了探讨miRNA-138对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响，我们应用脂质体转染法成功将miRNA-138模拟物转染至MDA-MB-231细胞中，成功建立过表达miRNA-138的乳腺癌细胞模型，Transwell迁移和侵袭实验结果显示，过表达miRNA-138的乳腺癌细胞穿膜细胞数明显较对照组减少，提示过表达miRNA-138能够明显抑制乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力。恶性肿瘤侵袭转移的具体分子机制非常复杂，涉及血管形成、细胞黏附能力变化、上皮间质转化(EMT)等多种因素，其中EMT是影响恶性肿瘤细胞侵袭转移的关键启动步骤[10,11]。

EMT是指在内外部因素的影响下，上皮细胞失去极性，细胞间紧密连接消失，获得侵袭和迁移能力，转化成为具有间质细胞特性细胞的过程[12]。研究[13,14]发现，EMT是恶性肿瘤发生侵袭转移的重要步骤。细胞发生EMT的过程中，E-cadherin、α-catenin等上皮细胞源性标志物表达明显缺失或降低，而Fibronectin、Vimentin、N-cadherin等间质细胞源性标志物表达明增加[15]。肿瘤细胞在发生EMT的过程中，E-cadherin 等细胞间隙黏连蛋白减少，肿瘤细胞形态发生改变，与此同时细胞侵袭及迁移能力也明显增加[16]。既往研究表明，miRNA-138在肾透明细胞癌[17]和胆囊癌[18]能通过调控EMT抑制肿瘤细胞的侵袭与迁移，但miRNA-138对乳腺癌EMT的影响尚未见报道。本研究发现，过表达miRNA-138的乳腺癌细胞中上皮细胞源性标志物E-cadherin蛋白表达较对照组明显升高，而间质细胞源性标志物Fibronectin、Vimentin蛋白表达的表达较对照组明显降低，证实miRNA-138能够通过抑制乳腺癌细胞EMT抑制乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力。

SOX4属于SOX家族的重要成员，其定位于人染色体6p22.3 上，在细胞分化的调控、胚胎发育及干细胞维持方面发挥着重要作用[19]。近年研究发现，SOX4在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中表达升高，作为原癌基因发挥作用。并且研究发现，SOX4与肿瘤细胞的EMT密切相关，是调控肿瘤细胞EMT的重要基因。在乳腺癌中也证实SOX4可以通过调控EMT促进乳腺癌细胞的侵袭转移。近期Liu等[17]证实，miRNA-138能够靶向调控SOX4基因的表达调控肾透明细胞癌EMT，从而影响肿瘤细胞的侵袭转移能力。为了观察在乳腺癌中miRNA-138是否也能够调控SOX4基因表达影响肿瘤细胞的EMT，我们通过Western blotting检测,发现过表达miRNA-138的乳腺癌细胞中SOX4蛋白的表达水平较对照组降低，证实miRNA-138可能通过调控SOX4基因调控乳腺癌细胞EMT过程，从而影响癌细胞的侵袭与迁移能力。

总之，miRNA-138 mimics能够抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移，其机制可能与调控SOX4基因抑制乳腺癌细胞EMT有关。miRNA-138有可能成为干预乳腺癌侵袭转移能力的新的治疗靶点，为乳腺癌的基因靶向治疗提供新的方向。