lncRNA RP11-769O8.2在肝癌组织、细胞系中的表达及其编码能力评估和靶基因预测

陈思宇，陈安宁，宋伟，刘玲珑，王鹏飞，姚清媚，吴帆，周素芳

(广西医科大学基础医学院，南宁 530021)

肝癌(HCC)是临床常见的恶性肿瘤，在癌症死亡原因中排在前列，且发病和死亡水平居高不下[1,2]。近年来，虽然临床上针对HCC的治疗手段不断更新，但治疗HCC的总体疗效并没有明显提高[3]。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多途径的复杂过程，涉及到多基因的参与[4]。研究[5～11]发现，除蛋白质编码基因能调节肿瘤外，一些非编码基因如长链非编码RNA(lncRNA)分子也参与了肿瘤发生发展的调控。在HCC中也存在多种lncRNA的表达改变，比如lncRNA MVIH、MALAT-1、HULC和H19等，这些lncRNA通过不同方式调控基因表达，参与了HCC的发生发展[12]。RP11-769O8.2是新发现的一种lncRNA，国内外研究尚未见相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR法(RT-PCR法)检测HCC患者组织及细胞系中RP11-769O8.2，另通过在线数据库评估其编码能力和预测其靶基因，以揭示RP11-769O8.2的作用机制及意义。

1 材料与方法

1.1 肝癌组织、细胞系及主要试剂、仪器 手术切除的HCC组织17例份[取自广西医科大学附属肿瘤医院2016年10月～2017年3月收治的患者，男14例、女3例，年龄31～60(48.8±9.3)岁，均经病理确诊，且未进行化疗]，保存于本实验室-80 ℃冰箱；另取癌旁组织(癌组织包膜1 cm外的癌周组织)作对照;临床病历资料完整，所有患者均知情同意。人HCC细胞系SK-Hep1、HepG2、Huh7、97L及人正常肝细胞系L-02由本实验室保存。DMEM高糖培养基购自美国Hy-Clone公司,胎牛血清、含EDTA胰酶购自Gibco公司,总RNA提取试剂盒购置于Omega Bio-Tek公司，逆转录试剂盒、荧光定量反应相关试剂、GAPDH内参引物购置于宝生物工程(大连)有限公司。PCR仪购自德国Biometra公司，荧光定量PCR仪购置于Eppendorf公司。

1.2 HCC组织、细胞系中RP11-769O8.2检测 采用qRT-PCR法。①HCC组织及癌旁组织：取30 mg冰上解冻的组织样品，用眼科剪剪碎后转到50 mL离心管加入1.5 mL裂解液及30 μL的β巯基乙醇，冰上放置，用高速分散匀质机破碎组织，置于冰上10 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清，后续按试剂盒步骤进行；②HCC细胞系：用0.5 mL胰蛋白酶将处于对数生长期的细胞消化下来，并用PBS洗3次。按试剂盒步骤提取RNA。逆转录和PCR反应均严格按照TaKaRa公司提供的说明书，以GAPDH作为内参进行相对定量，每组设3复孔，在实时定量荧光PCR仪上进行检测。RP11-769O8.2：5’-TCAGATTCTGTGGACATTTGGAG-3’，5’-GCCTTAT-TATTGGCTTTGGTTG-3’；内参GAPDH引物：5’-GC-ACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，5’-TGGTGAAGACG-CCAGTGGA-3’。以2-ΔΔCt法代表RP11-769O8.2的相对表达量。

1.3 RP11-769O8.2编码能力评估及其靶基因预测 使用在线数据库Coding Potential Calculator Online(http://cpc.cbi.pku.EdU.cn/)预测RP11-769O8.2编码能力。根据顺式(cis)作用模式预测其靶基因，使用UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)寻找RP11-769O8.2周围邻近的靶基因。

1.4 HCC组织、细胞系中YES原癌基因1(YES1)检测 采用qRT-PCR法。①HCC及癌旁组织：称取30 mg冰上解冻的组织样品，用眼科剪剪碎后转到50 mL离心管加入1.5 mL裂解液及30 μL的β巯基乙醇，冰上放置，用高速分散匀质机破碎组织，置于冰上10 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清，后续按试剂盒步骤进行；②HCC细胞系：用0.5 mL胰蛋白酶将处于对数生长期的细胞消化下来，并用PBS洗3次。按试剂盒步骤提取RNA。逆转录和PCR反应均严格按照TaKaRa公司提供的说明书，以GAPDH作为内参进行相对定量，每组设3复孔，在实时定量荧光PCR仪上进行检测。YES1：5′-CCCTCCTCCTGAAGTAACGC-3′，5′-CTCATGAGTCGCTGCTACCG-3′；内参GAPDH：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt法计算YES1的相对表达量。

2 结果

2.1 HCC组织、细胞系中RP11-769O8.2表达比较 HCC、癌旁组织中RP11-769O8.2表达量分别为13.22±2.04、11.72±2.36，两者比较，P<0.05。SK-Hep1、Huh7、HepG2、97L细胞系中RP11-769O8.2相对表达量分别为0.32±0.01、1.50±0.04、2.35±0.24、1.21±0.15，SK-Hep1表达与其他三者比较，P均<0.05。

2.2 RP11-769O8.2表达与HCC临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，RP11-769O8.2表达与HCC肝硬化程度相关(P<0.05)。

2.3 RP11-769O8.2编码能力及靶基因 Coding Potential Calculator Online在线数据库显示RP11-769O8.2的编码能力评分为-1.28，提示蛋白质编码能力弱，而作为编码RNA阳性对照的TP53 mRNA和GAPDH mRNA的编码能力评分分别为8.25和2.24，均远大于RP11-769O8.2。UCSC数据库检测显示，RP11-769O8.2是编码YES1的剪切体，由两段外显子序列转录组成，位于YES1反义链，YES1 mRNA可能有转录激活与表达调控方式，因此将YES1选为RP11-769O8.2的靶基因。

表1 RP11-769O8.2表达与HCC患者临床病理参数的关系

2.4 HCC组织、细胞系中YES1表达比较 HCC、癌旁组织中YES1表达量分别为13.22±2.04、11.72±2.36，两者比较，P<0.05。SK-Hep1、Huh7、HepG2、97L细胞系中YES1相对表达量分别为0.48±0.23、1.82±0.62、2.56±1.04、1.86±0.79，L-02与其他三者比较，P均>0.05。

2.5 RP11-769O8.2与YES1的相关分析结果 HCC组织中RP11-769O8.2、YES1的相对表达量分别为1.5±1.5、2.35±1.49；以RP11-769O8.2在HCC组织与癌旁组织中的相对表达量为X轴，以YES1在HCC组织与癌旁组织中的相对表达量Y轴，制作散点图，判断RP11-769O8.2与YES1的相关趋势，线性相关分析得到Pearson相关系数为0.597，P<0.05，显示RP11-769O8.2与YES1的表达量呈正相关。

3 讨论

原发性HCC，是由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的癌肿，是我国常见恶性肿瘤之一，是一种死亡率较高的肿瘤疾病，男性中发病率高于女性。HCC组织细胞学分类较多，其中SK-Hep1为肝/腹水细胞癌细胞系；HepG2细胞系于1979年，从阿根廷一名15岁高加索男孩的原发性肝胚细胞瘤中分离出并建立，该细胞系呈上皮样，贴壁抱团生长；Huh7细胞系于1982年从一名患有HCC的57岁日本男性HCC组织标本上培养而得。该细胞AFP阳性，高度分化，细胞呈上皮样，贴壁生长；97L细胞系由上海医科大学中山医院建立，将一名我国39岁男性HCC患者的肝右叶转移病灶的手术切除标本接种于裸鼠肝内建造出人HCC裸鼠转移模型而得。

lncRNA数量比较多，大约是mRNA的3～100倍，这些类似mRNA的转录本在各种基因调控水平和胚胎发育等生物学过程中发挥作用。越来越多的证据也表明，异常表达的lncRNA在多种疾病状态中发挥重要作用，如癌症。这些RNA尽管在十几年前就已经发现，但只有少数分子的功能得到鉴定，仍有很大的研究空间。而RP11-769O8.2是新发现的一种lncRNA，其对HCC的作用及机制目前国内外尚未见相关报道。RP11-769O8.2是编码YES1蛋白的剪切体，由两段外显子序列转录组成，位于YES1的反义链上。本研究显示，HCC组织中RP11-769O8.2的相对表达量低于癌旁组织，SK-Hep1 RP11-769O8.2的相对表达量低于Huh7、HepG2、97L，RP11-769O8.2表达水平的降低与患者肝硬化程度有关。提示RP11-769O8.2表达水平可能与HCC的发生发展有密切联系。

Coding Potential Calculator Online在线数据库评估RP11-769O8.2编码能力得分为-1.28，提示蛋白质编码能力弱，其评分远远小于作为编码RNA阳性对照的TP53 mRNA编码能力评分8.25及GAPDH mRNA 2.24。cis调控就是指非编码RNA对临近mRNA的一种转录激活与表达调控方式。研究发现，基因调控可能以顺式(cis)或反式(trans)作用形式发生。其中cis调控主要依赖顺式作用元件进行，顺式作用元件是指存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与核内基因表达的调控，顺式作用元件通常转录为非编码RNA，如lncRNA[13]。通过生物信息学预测发现，RP11-769O8.2位于YES1反义链上，可能通过cis调控机制影响YES1的表达，进而在癌症中发挥作用。YES1作为可以调节细胞增殖、黏附和分化的关键因子，是Src家族激酶中的一员。YES1在许多肿瘤中均有较高的表达水平[14]，已被认为是许多癌症的潜在治疗目标，包括黑色素瘤、乳腺癌和横纹肌肉瘤等[15]。本研究发现，与L-02比较，YES1在SK-Hep1中表达水平最低，而在Huh7、97L中的表达水平相近，在HepG2中的表达水平最高，L-02表达与HCC各细胞系比较均无显著性差异；而YES1在HCC组织中的表达明显低于癌旁组织。相关性分析显示,RP11-769O8.2及其靶基因YES1呈正相关性。提示YES1可能是RP11-769O8.2的作用靶点，且与HCC的发生发展有密切关系。

总之，RP11-769O8.2在HCC组织标本中低表达，与患者的肝硬化程度相关，编码能力弱；且RP11-769O8.2的表达与YES1的表达呈正相关，可能是潜在的HCC预后预测分子标志物。但由于样本量不大，且缺乏进一步的分子生物学及实验室数据，关于RP11-769O8.2在HCC中的具体作用及分子机制尚需更加深入研究。