MiR-499靶向HMGB1保护缺氧复氧心肌细胞损伤的分子机制探讨

周慧良，甘受益，李宾，冯光瑞，宋巧巧，王淼

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是进化上高度保守的非组蛋白染色质结合蛋白[1]。应激状态下，活化的免疫细胞和受损细胞将HMGB1释放到细胞外，其中HMGB1作为促炎介质发挥作用并在炎性疾病的发病机制中起重要作用[2]。最近研究表明，炎症小体，细胞内蛋白质复合物，响应各种外源性和内源性危险信号，并调节激活的免疫细胞释放HMGB1[3]。鄂璐莎等[4]在心肌缺血/再灌注损伤的研究中阐明，缺血/再灌注可使大鼠心肌中HMGB1表达上调，心肌组织中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、内质网应激蛋白（CHOP）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase-12）的表达上调，且沉默HMGB1可明显减轻内质网应激水平。内质网功能紊乱，细胞将启动caspase12依赖的细胞凋亡。据报道，HMGB1在缺氧复氧心肌损伤中发挥关键作用，但其具体的作用及机制尚未完全清楚。miRNA为一类内源性的小核苷酸片段，约30%的人类基因受miRNA的调节[5]。miRNA在很多心脏病的发生发展中也具有重要作用，近几年出现很多miRNA治疗心脏病的研究。柳培宇等[6]发现，miRNA-214在心肌损伤中表达上调且具有保护心肌损伤功能。miR-499为肌球蛋白基因编码的miRNA家族成员，其主要在动物体的心肌、骨骼肌中表达，在心肌细胞的分化中起关键作用[7]。但miR-499在缺氧复氧心肌细胞中的作用机制尚未十分清楚。本研究将建立缺氧复氧心肌细胞H9c2损伤模型，检测miR-499、HMGB1的表达，观察过表达miR-499、敲减HMGB1、过表达HMGB1对缺氧复氧H9c2细胞凋亡的影响，揭示miR-499可抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡，其机制可能与靶向结合HMGB1有关，将为心脏病的预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料心肌细胞H9c2购自美国菌种保藏中心（ATCC）；BCA蛋白定量试剂盒、脂质 LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）（Annexin V-FITC/PI）双染色法凋亡检测试剂盒购于Takara公司；改良Eagle培养基（DMEM）培养基、胎牛血清均购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及模型制造将心肌细胞H9c2用含

10%胎牛血清的DMEM培养液，放在恒温培养箱中进行培养，待细胞呈正常增殖状态时，将含有胎牛血清的DMEM培养液更换为低氧缓冲液（139 mM NaCl，4.7 mM KCl，0.5 mM MgCl2，1.0 mM CaCl2，5 mM Hepes，20 mM CH3CHOHCOONa 乳酸钠），并放置于气体组成为（95% N2，5% CO2）的缺氧复氧培养箱进行缺氧培养12 h，然后去掉培养液，重新加入含有胎牛血清的 DMEM培养基，放置于37℃，20% O2，5% CO2中培养4 h，即完成缺氧复氧（H/R）心肌细胞模型制造。

1.2.2 细胞转染为探究miR-499、HMGB1对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响，我们使用LipofectamineTM2000脂质体试剂将H/R+miRcon组（转染miR-con）、H/R+miR-499组（转染miR-499 mimics）、miR-con组（转染miRcon）、miR-499组（转染miR-499 mimics）、anti-miR-con组（转染anti-miR-con）、antimiR-499组（转染anti-miR-499）、H/R+si-con组（转染si-con）、H/R+si-HMGB1组（转染si-HMGB1）、H/R+miR-499+Ctrl组（miR-499 mimics和pcDNA3.1共转染）、H/R+miR-499+HMGB1组（miR-499 mimics和pcDNA3.1-HMGB1共转染），转染至H9c2细胞，转染8 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，然后按照1.2.1方法进行缺氧复氧细胞模型制造，最后用qRT-PCR法检测转染的效率，确认转染成功后将各组细胞用于 Western blot实验、qRT-PCR实验、Annexin V-FITC/PI双染色法细胞凋亡检测实验、双荧光素酶报告基因检测实验。

1.2.3 Western blot实验取适量对数生长期1.2.2各组细胞，用RIPA裂解，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量后变性，进行蛋白电泳，再行PVDF转膜，封闭2 h，然后用Ⅰ抗，4℃孵育过夜。次日，洗膜后用辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗37℃孵育2 h。结束后加入显影混合液，显影曝光。以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白HMGB1、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、免抗人单克隆抗体（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）的表达。

1.2.4 qRT-PCR实验取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行miR-29c检测。用2-△△Ct计算miR-499的表达。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡取适量对数生长期1.2.2各组细胞，用预冷的PBS洗涤3次。另用结合缓冲液500 μl悬浮细胞，之后加入5 μl的 Annexin V-/FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。细胞凋亡率采用流式细胞仪分析测定。细胞凋亡率（%）= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测实验取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册要求操作。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，psiCHECK2-HMGB1-3 UTR WT和psiCHECK2-HMGB1-3 UTR MUT的表达为对照，转染24 h后，检测荧光强度。海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值即反应miR-499与HMGB1的结合力。

1.2.7 统计学处理实验所用数据均使用SPSS 21.0软件分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧复氧H9c2心肌细胞对miR-499和HMGB1表达的影响运用Western blot检测缺氧复氧H9c2心肌细胞中HMGB1的蛋白表达，与NC组相比，H/R组细胞中HMGB1的蛋白表达显著升高（图1，表1）。用qRT-PCR法检测缺氧复氧H9c2心肌细胞中miR-499的表达水平，与NC组相比，H/R组细胞中miR-499表达显著降低（表1），均具有统计学意义（P均＜0.05）。

图1 缺氧复氧H9c2心肌细胞中HMGB1蛋白的表达

表1 缺氧复氧H9c2心肌细胞中miR-499和HMGB1的表达（n=9）

图2 过表达miR-499对缺氧复氧H9c2心肌细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响

表2 过表达miR-499对缺氧复氧心肌细胞H9c2凋亡的影响（n=9）

2.2 过表达miR-499抑制缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡运用流式细胞术检测过表达miR-499对缺氧复氧H9c2心肌细胞的凋亡率，与NC组相比，H/R组、H/R+miR-con组细胞中miR-499表达均显著降低，Bcl-2蛋白表达均显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高（图2），凋亡率均显著升高（表2），差异均具有统计学意义（P均＜0.05）；与H/R+miR-con组相比，H/R+miR-499组细胞中miR-499表达均显著升高，Bcl-2蛋白表达均显著升高，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著降低（图2），凋亡率均显著降低（表2），差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。可见，过表达miR-499抑制缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡。

2.3 miR-499靶向HMGB1通过TargetScan对miR-499和HMGB1的结合进行预测，发现miR-499与HMGB1存在结合位点（图3A）。与miR-con组相比，miR-449组HMGB1的蛋白表达显著降低，与anti-miR-con组相比，antimiR-499组HMGB1的蛋白表达显著升高（图3B，表4）。运用双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞荧光活性，与miR-con组相比，miR-449组WT处理的细胞荧光活性显著降低，MUT处理的细胞荧光活性变化不显著（表3），均具有统计学意义（P均＜0.05）。可见，miR-449靶向HMGB1。

2.4 敲减HMGB1抑制缺氧复氧H9c2心肌细胞的凋亡将si-con、si-HMGB1转染H/R H9c2心肌细胞，分别标记为H/R+si-con组、H/R+si-HMGB1组。与对照组相比，H/R组细胞中HMGB1蛋白表达均显著降低，Bcl-2蛋白表达均显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高（图4），凋亡率均显著升高（表5）；与H/R+si-con组相比，H/R+si-HMGB1组细胞中HMGB1蛋白表达均显著降低，Bcl-2蛋白表达均显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高（图4），凋亡率均显著升高（表5），均具有统计学意义（P＜0.05）。可见，敲减HMGB1抑制缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡。

2.5 过表达HMGB1逆转miR-499对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用将miR-499 mimics和pcDNA 3.1共转染至H/R H9c2心肌细胞，标记为H/R+miR-499+Ctrl组，miR-499 mimics和pcDNA 3.1-HMGB1共转染至H/R H9c2心肌细胞，标记为H/R+miR-499+HMGB1组。与H/R+miR-con组相比，H/R+miR-449组细胞HMGB1蛋白表达均显著降低，Bcl-2蛋白表达均显著升高，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著降低（图5），凋亡率均显著降低（表6）；与H/R+miR-499+Ctrl组相比，H/R+miR-499+HMGB1组细胞中HMGB1蛋白表达均显著升高，Bcl-2蛋白表达均显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高（图5），凋亡率均显著升高（表6），均具有统计学意义（P＜0.05）。可见，过表达HMGB1逆转miR-499对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用。

图3 HMGB1为miR-499的靶基因

表3 miR-499对H9c2心肌细胞荧光活性的影响（n=9）

表4 H9c2心肌细胞中HMGB1的蛋白表达量（n=9）

注：HMGB1：高迁移率族蛋白1；与miR-con组比较，aP＜0.05；与anti-miR-con组比较，bP＜0.05

图4 敲减HMGB1对缺氧复氧H9c2心肌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

表5 敲减HMGB1对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡的影响（n=9）

图5 过表达HMGB1对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

miRNA为长度在19-25个核苷酸长度的非编码微小RNA（ncRNA），其可调节基因表达[8]。miRNA在心脏生物学、癌症及其他疾病中均具有重要作用，但miRNA在心脏病中研究较少，其潜在治疗作用尚需继续开发[9]。孙小琴等[10]研究发现miR-499过表达能通过靶向SOX6抵抗缺氧诱导的神经PCI2细胞损伤，提高细胞活力，并降低细胞凋亡率。而岳莹等[11]发现，缺氧复氧心肌细胞中miR-499表达下调，Caspase-3蛋白表达上调、PI3K/Akt信号通路失活，而miR-499可以通过活化PI3K/Akt信号通路，减少缺氧/复氧所诱导的心肌细胞的凋亡。郑重洲等[12]研究也表明miR-499在H/R的H9C2细胞中低表达，且过表达miR-499可下调H/R H9C2细胞中JNK、Caspase-3的表达，抑制H/R H9c2细胞凋亡。本实验结果和他们的研究结果一致，也证明了miR-499在缺氧/复氧的心肌细胞中表达水平显著降低，过表达miR-499可显著下调Bax、Caspase-3的蛋白表达，上调Bcl-2的蛋白表达，且降低缺氧/复氧H9c2细胞的凋亡率。提示miR-499在缺氧/复氧所致的心肌细胞损伤中具有重要作用，其或可作为治疗心肌细胞损伤的靶点。

表6 过表达HMGB1逆转miR-499对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用（n=9）

HMGB1是一种免疫炎症细胞分子，参与调节免疫反应[13,14]。且HMGB1能够结合DNA，维持核酸结构和基因转录，当其释放到细胞外环境时，可充当炎症的介质[15,16]。细胞外HMGB1有助于许多慢性炎症和自身免疫疾病的发病，包括败血症，类风湿性关节炎，动脉粥样硬化，慢性肾病，系统性红斑狼疮（SLE）及癌症[17,18]。邓秋菊等[19]研究发现缺氧复氧诱导的心肌细胞中HMGB1高表达，敲低HMGB1可减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤。赵丽华等[20]发现下调 HMGB1表达可降低Caspase-3的水平，提高SOD、p-STAT3的水平，降低缺氧复氧对心肌细胞的氧化损伤进而抑制心肌细胞凋亡。邵忠华等[21]发现针灸可预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制与减少HMGB1的表达有关。以上研究结果均表明 HMGB1参与了缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡，下调其表达可减轻氧化损伤。但均为说明其可能的作用机制。而本研究结果不仅证明了在缺氧复氧的心肌细胞中HMGB1上调表达，敲减HMGB1可下调Bax、Caspase-3的蛋白表达，显著抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡。此外还发现HMGB1被miR-499靶向调控，过表达HMGB1可逆转miR-499对H/R诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用。提示，HMGB1减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的机制或与miR-499有关。还有研究发现缺氧-复氧模拟肾缺血-再灌注可诱导HK2细胞HGMB1/TLR-4信号通路活化，参与调控TNF-α、IL-1β炎症介质的表达及HK2细胞的凋亡[22,23]。即HGMB1通过调控炎症介质介导细胞凋亡，而本实验未研究炎症介质的表达，今后可进一步从此角度进行相关研究，更清楚的了解HGMB1的作用机制，为临床应用提供理论依据。

综上所述，miR-499可抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡而发挥保护作用，其机制与靶向调控HMGB1的表达有关，将可为心血管疾病的治疗奠定基础，提供新靶点。