尘肺患者外周血miR-21表达与细胞因子分泌、胶原代谢及氧化应激的相关性

董明霞, 庞波, 李茜, 李娟，刘丽

肺尘埃沉着病简称尘肺，是由长期吸入生产性粉尘引起的职业病，以肺间质弥漫性纤维化为主要病理特征[1-2]。当尘肺患者出现肺纤维化时，局部组织的病理改变难以逆转，患者的肺功能会呈现出进行性减退的趋势并造成生活质量下降，临床治疗难度大。在生产性粉尘吸入并在肺内潴留后，粉尘能够刺激局部组织起炎性反应、氧化应激反应激活并造成组织损伤，在组织损伤的修复过程中多种细胞因子的大量分泌能够造成胶原异常沉积并逐步形成纤维化。目前，细胞因子分泌、胶原代谢、氧化应激异常等病理环节与尘肺病情发展变化的关系受到越来越多关注[3-4]，但调控上述病理环节的机制尚未明确。微小RNA(micro RNA)是近年来新发现的非编码RNA，能够通过调节多种基因的表达来产生相应的生物学效应，其中miR-21是已知在尘肺病程中发挥明显改变的miRNA[5]。为了明确miR-21表达改变与尘肺病程中病理环节的关系，现分析尘肺患者外周血miR-21表达与细胞因子分泌、胶原代谢、氧化应激的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年3月—2018年2月四川省攀枝花市第二人民医院职业病科诊治尘肺患者43例作为尘肺组， 男29例，女14例，年龄49～63 (56.41±7.93)岁，病程3～11 (6.51±0.71)年；尘肺I期18例，II期16例，III期9例;合并高血压11例、糖尿病8例，有哮喘家族史6例；另取同期在我院进行健康体检的志愿者60例作为对照组，男38例，女22例，年龄45～60(54.85±7.34)岁;合并高血压14例，糖尿病12例，有哮喘家族史9例。2组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 选择标准 纳入标准 ：(1)符合尘肺病诊断标准[6]；(2)首次诊断且未接受过对症治疗；(3)取得患者及家属知情同意。排除标准：(1)合并肺内恶性肿瘤、肺结核、肺部感染急性期的患者；(2)合并自身免疫性疾病、内分泌系统疾病的患者；(3)肝肾功能不全的患者。

1.3 观测指标与方法 入组后，于晨起空腹采集2组人员空腹肘静脉血8 ml 待用。

1.3.1 miR-21表达量测定： 上述静脉血2 ml，采用miRNA提取试剂盒分离miRNA， miRNA cDNA第一链合成试剂盒将外周血中的miRNA反转录为cDNA， miRNA荧光定量PCR检测试剂盒对目的基因miR-21及内参基因U6进行扩增，按照miR-21/U6计算miR-21的表达量。试剂盒由康为世纪公司提供。

1.3.2 血清指标测定： 上述静脉血6 ml，离心分离血清采用酶联免疫吸附法测定。(1)细胞因子：转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、结缔组织生长因子(CTGF)；(2)血清胶原代谢指标：基质金属蛋白酶(MMP-9)、纤溶酶原激活物(uPA)、胶原蛋白-I(Col-I)、胶原蛋白-III(Col-III)；(3)氧化应激指标：8-异前列腺素 F2α(8-iso-PGF2α)、一氧化氮(NO)、总抗氧化力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。试剂盒由上海西唐公司提供。

2 结 果

2.1 miR-21表达量比较 外周血miR-21的表达量尘肺组为1.88±0.25，高于对照组的1.04±0.18 (t=19.837，P=0.000)。

2.2 血清细胞因子比较 尘肺组血清TGF-β1、TNF-α、CTGF含量明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 2组血清细胞因子含量比较

2.3 血清胶原代谢指标比较 尘肺组血清MMP-9、uPA、Col-I、Col-III含量高于对照组(P<0.05)，见表2。

2.4 血清氧化应激指标比较 与对照组比较，尘肺组血清8-iso-PGF2α、NO含量明显升高，T-AOC、SOD的含量明显降低(P<0.05)，见表3。

2.5 相关性分析 外周血miR-21表达量与血清TGF-β1、TNF-α、CTGF、MMP9、uPA、Col-I、Col-III、8-iso-PGF2α、NO含量呈正相关(r/P=0.652/0.004、0.474/0.024、0.512/0.018、0.423/0.029、0.559/0.020、0.609/0.009、0.541/0.014、0.629/0.008、0.635/0.006)；与血清T-AOC、SOD含量呈负相关(r/P=-0.577/0.013、-0.519/0.019)。

表2 2组血清胶原代谢指标比较

表3 2组血清中氧化应激指标的比较

3 讨 论

尘肺是我国发病率最高的职业病之一，长期吸入生产性粉尘是疾病的直接病因，而粉尘在肺内潴留所引起的肺纤维化则是疾病的病理特征。尘肺的发病机制未明，增加了临床治疗的难度。miR-21是近年来新发现的与多种组织纤维化密切相关的miR。本研究的分析显示：尘肺组患者外周血中miR-21的表达量明显高于对照组。关于miR-21多项动物实验报道，miR-21对肺脏、肾脏、心脏组织的纤维化均具有促进作用，调控炎性反应、胶原代谢、氧化应激，是miR-21在实验动物体内发挥促纤维化作用的分子途径[7-9]。本结果提示：miR-21的高表达与尘肺的发生发展有关，高表达的miR-21能够通过促进肺纤维化来参与尘肺的发生发展。

粉尘在肺内潴留能够刺激TGF-β1、TNF-α、CTGF等多种细胞因子在局部组织内大量分泌，进而通过细胞因子各自的生物学活性来促进组织发生纤维化。本研究的分析显示：尘肺组患者血清TGF-β1、TNF-α、CTGF的含量明显高于对照组，且与血清细胞因子的含量与外周血中miR-21的表达量呈正相关。TGF-β1是目前已知促纤维化作用最显著的细胞因子，一方面能够参与成纤维细胞的活化并促进纤维结缔组织增生；另一方面能够促进胶原蛋白、黏连蛋白相互结合并在细胞外基质内大量沉积，两方面因素共同作用，能够加重组织纤维化[10]；TNF-α是具有促炎活性的细胞因子，粉尘刺激TNF-α分泌后能够在局部招募多种炎性细胞，进而通过炎性细胞所分泌的蛋白酶来影响细胞外基质分布、促进组织纤维化[11]；CTGF是受到TGF-β1调控的细胞因子，也可由炎性细胞大量分泌，能够促进成纤维细胞发生增殖并参与组织纤维化的过程[12]。结果提示：尘肺患者体内高表达的miR-21能够增加多种细胞因子的分泌，进而通过细胞因子的生物学活性来促进肺组织发生纤维化。

在尘肺患者发生肺纤维化的过程中，细胞因子大量分泌能够直接影响细胞外基质中胶原蛋白水解和沉积的平衡，TGF-β1等细胞因子对蛋白酶活性的增强作用以及TNF-α等细胞因子对蛋白酶分泌的刺激作用能够使细胞外基质中的胶原蛋白发生过度水解。MMP-9是具有强大胶原水解活性的蛋白酶，uPA是通过纤溶酶来参与组织纤维化调控的分子，该分子能够使纤溶酶原活化为纤溶酶并促进细胞外基质不断水解[13]。当细胞外基质内的胶原大量水解后，机体能够进行自身代偿并使多种类型的胶原在邻近组织发生合成和沉积，胶原异常的降解和沉积共同促进了肺纤维化[14]。尘肺组患者血清MMP-9、uPA、Col-I、Col-III的含量明显高于对照组，且与血清中胶原代谢指标的含量与外周血中miR-21的表达量呈正相关。这一结果表明尘肺患者体内高表达的miR-21能够促进细胞外基质内的胶原代谢发生紊乱，进而通过胶原代谢的改变来促进肺组织发生纤维化。

尘肺病程中肺纤维化是局部组织自身修复的过程，而与尘肺患者局部肺组织损伤关系最密切的病理环节是氧化应激反应。粉尘在肺内潴留能够促进氧自由基大量生成并与肺泡上皮、血管内皮、肺间质等发生氧化应激损伤，进而通过细胞外基质降解及沉积的改变来实现损伤修复，同时也逐步产生纤维化[15]。尘肺组血清中8-iso-PGF2α、NO的含量明显高于对照组，且氧化产物与外周血中miR-21的表达量呈正相关，T-AOC、SOD的含量明显低于对照组且抗氧化物与外周血中miR-21的表达量呈负相关。8-iso-PGF2α、NO是氧自由基引起组织氧化损伤过程中的产物，两者含量能够直接反映氧自由基的生成量，进而对氧化应激损伤的程度做出评估。SOD是具有还原活性的催化酶，通过介导还原反应来清除氧自由基并减轻组织所受到的氧化损伤，但持续大量生成的氧自由基会增加SOD的消耗并使T-AOC降低。本结果表明：尘肺患者体内高表达的miR-21能够促进氧自由基的生成以及抗氧化物的消耗，进而通过氧化应激反应来造成组织损伤及纤维化。

总之，尘肺患者外周血miR-21的表达升高；高表达的miR-21能够造成尘肺病程中细胞因子异常分泌、胶原代谢紊乱、氧化应激激活，进而引起肺纤维化。

利益冲突：无

作者贡献声明

董明霞、刘丽：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；庞波、李茜：提供材料，分析试验数据;李娟：实施研究过程，进行统计学分析及论文审核修改