兔VX2肝癌经导管动脉栓塞术后癌旁肝组织氧化应激及细胞凋亡

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(大理大学第一附属医院放射科，云南 大理 671000)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma， PHC)是常见恶性肿瘤之一。我国肝癌发病率逐年上升[1]，且多数患者在确诊时已经失去手术切除或肝移植治疗机会[2]。近年来，经导管动脉栓塞(transcatheter arterial embolization, TAE)已逐渐成为治疗PHC的首选方法[3-4],其肿瘤局部控制率较高，但术后患者出现不同程度肝功能下降，影响生存质量[5]。本研究建立兔VX2肝癌模型，观察TAE术后癌旁肝组织氧化应激及凋亡情况，旨在分析TAE术后氧化应激及细胞凋亡在癌旁肝组织损伤中的作用，为临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 兔VX2肝癌模型建立 选取健康新西兰大白兔37只(由大理大学动物中心提供)，雌雄不限，体质量2.50～3.50 kg，平均(2.85±0.25)kg；荷瘤兔2只(由东南大学附属中大医院惠赠)。采用改良CT定位下瘤块注射法[6]，对37只新西兰大白兔建立VX2肝癌模型，2周后经CT和/或MR检查证实25只建模成功(图1)。

1.2 实验模型分组及处理 将兔VX2肝癌模型随机分为TAE组(n=13)及对照组(n=12)。采用GE Innova-3100IQ DSA引导，对TAE组行肝动脉罂粟乙碘油注射液及明胶海绵颗粒栓塞。采用3%戊巴比妥钠麻醉实验兔后，将其保定于自制实验操作台上，对右侧腹股沟附近10 cm范围内备皮、消毒后做一切口，以18G穿刺针穿刺右股动脉后引入4F导管鞘及导管，通过导丝选择至腹腔干，以同轴技术将TERUMO微导管(泰尔茂公司)超选择至肝总动脉，造影明确肿瘤供血动脉后，经微导管注射罂粟乙碘油(图2A)，常规剂量(ml)=肿瘤直径(cm)×0.2，依据个体肿瘤供血情况适当增减[7]；之后以明胶海绵颗粒进行栓塞，直至供血动脉血流缓慢停止(图2B)。术毕拔管并结扎肝动脉近端，处理切口。常规饲养对照组实验兔，对其不进行任何处理。

1.3 实验室检查 分组处理后3天，对2组实验兔均经耳缘静脉抽血并行实验室检查，以评价其肝功能，包括：丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、总胆红素(total bilirubin time, TBI)、血清白蛋白(serum albumin, ALB)及凝血酶原时间(prothrombin time, PT)。

1.4 离体标本处理 完成实验室检查后处死实验兔，并于其左上腹剑突下行腹正中切口，完整取出肝脏，分离肿瘤组织与癌旁肝组织(距肿瘤>2 cm)[8]，作为实验标本。

1.5 组织病理检查 对2组肿瘤组织及癌旁肝组织标本均进行固定及石蜡包埋、切片(厚度3～4 μm)及HE染色，采用Olympus BX41光学显微镜行组织病理学检查。

1.6 生物酶学检测 分别采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、过氧化氢酶(catalase， CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase， GSH-PX)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，对2组癌旁肝组织标本进行检测。

1.7 细胞凋亡检测 采用细胞凋亡检测试剂盒(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)，对2组癌旁肝组织标本进行检测，以TUNEL法评估细胞凋亡情况。细胞核内着色呈褐色(包括深、浅褐色)或棕黄色即为凋亡细胞。凋亡指数(apoptosis index， AI)计算：在高倍光学显微镜(×400)下随机记数10个视野，分别计算该视野内凋亡细胞所占百分比，取平均值作为AI。

1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件。计量资料以±s表示，2组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能指标变化 与对照组比较，TAE组ALT、AST、TBI升高，ALB降低，PT延长，差异均有统计学意义(P均<0.001)，见表1。

2.2 病理改变 组织病理学检查显示，2组兔VX2肝癌模型肿瘤组织细胞均呈条索状、巢状或呈腺管样排列，核大，癌巢周围可见血管内皮细胞包绕；TAE组癌旁肝组织轻度脂肪变性，同时可见大量炎性细胞浸润，以单核细胞、中性粒细胞为主(图3A)；对照组癌旁肝组织仅见轻度脂肪变性(图3B)。

表1 TAE术后各组肝功能指标测定值(±s)

表1 TAE术后各组肝功能指标测定值(±s)

组别ALT(U/L)AST(U/L)TBI(μmol/L)ALB(g/L)PT(s)TAE组(n=13)83.89±16.33117.37±18.7620.60±1.8333.53±1.3515.68±0.96对照组(n=12)53.07±7.6376.37±13.2914.75±1.6036.45±1.1013.51±0.73t值-6.118-6.530-7.9305.936-6.318P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

表2 各组癌旁肝组织SOD、GSH-PX和 CAT的测定值(U/mgprot，±s)

表2 各组癌旁肝组织SOD、GSH-PX和 CAT的测定值(U/mgprot，±s)

组别SODCATGSH-PXTAE组(n=13)21.81±1.341.15±0.14187.68±4.83对照组(n=12)45.48±1.643.09±0.34262.62±4.45t值39.69318.24140.221P值<0.001<0.001<0.001

图1 兔VX2肝癌模型CT表现 A.CT平扫示肝实质内不均匀低密度病灶，肿瘤中心密度较低(箭)； B.CT增强扫描可见肿瘤边缘呈不均匀明显强化，中心坏死区无强化(箭) 图2 兔VX2肝癌模型TAE术中DSA表现 A.腹腔干造影示肿瘤血管推移呈“抱球征”(箭)； B.超选择性插管至肿瘤供血动脉后推注罂粟乙碘油，可见肿瘤区碘油沉积(箭)

2.3 癌旁肝组织生物酶活性 生物酶学检测显示，TAE组SOD、GSH-PX、CAT均低于对照组(P均<0.001)，见表2。

2.4 癌旁肝组织中细胞凋亡情况 TUNEL染色结果显示，TAE组癌旁肝组织中细胞凋亡明显(图4)。TAE组及对照组AI分别为(64.20±2.77)%和(2.20±1.90)%，差异有统计学意义(t=-112.30，P<0.001)。

3 讨论

人体肝脏接受肝动脉和门静脉双重血供，肝动脉血流阻塞时，门静脉可代偿供血，以维持肝脏正常功能。肝动脉可提供99%左右的肝肿瘤供血，为TAE治疗PHC提供了理论支持[9]。目前TAE已成为无法外科手术切除的中晚期肝癌的有效治疗方法，但由于肝血窦及肝内侧支循环丰富，TAE治疗时栓塞剂不可避免地进入肿瘤周围正常肝组织并沉积于微小动脉和毛细血管内，导致组织缺血、缺氧，从而使肝组织内产生大量的活性氧，引发一系列复杂的内源性反应，导致肝细胞坏死、凋亡[10]，即使采用超选择性栓塞仍不能避免TAE术后肝功能下降。此外，过多的自由基会引起机体产生氧化应激，导致组织损伤。SOD、GSH-PX、CAT是生物体细胞内产生的天然自由基清除系统[11]，属于酶促抗氧化系统，一方面可阻断体内脂质的过氧化进程，另一方面将有害的脂质过氧化物还原成无害羟基化合物。SOD、GSH-PX、CAT均可反映生物体去除氧自由基的能力，其中SOD最为关键[12]。肝脏血流被阻断并再重新恢复供应后，产生大量活性氧,具有较活跃的化学性质，极易与肝细胞膜上的重要功能与结构蛋白发生过氧化反应，从而引起肝细胞损伤和凋亡[13]。研究[14]报道，SOD等能够及时清除组织和细胞内的活性氧，保护机体免受过氧化损伤。本研究建立兔VX2肝癌模型，探讨TAE术后癌旁肝组织中氧化应激及细胞凋亡在癌旁肝组织损伤中的作用，结果显示TAE组癌旁肝组织中SOD、GSH-PX、CAT活性较对照组均明显下降，提示TAE术后癌旁肝组织发生氧化应激，破坏了肝细胞正常的生理功能。

图3 兔VX2肝癌模型离体肿瘤组织标本病理图(HE，×40) A.TAE组； B.对照组 图4 兔VX2肝癌模型离体癌旁肝组织细胞凋亡情况(TUNEL法，×40) A.TAE组； B.对照组

细胞凋亡是机体在发育过程中或某些因素作用下，通过一系列复杂调控而发生的一种程序性细胞死亡。组织缺血、缺氧，产生大量氧自由基及肿瘤浸润等病理因素均可导致细胞凋亡。本研究中的TUNEL染色结果显示，TAE组癌旁肝组织AI明显高于对照组，提示细胞凋亡与TAE术后肝损伤有关，与既往研究[15]结果相符。

由于本实验样本量较小，加之检测方法的局限性及研究因素不够全面，对TAE术后癌旁肝组织损伤的机制研究不够深入和透彻，将在今后的研究中进一步分析聚合酶链式反应、免疫印迹、质粒转染和基因敲除等方法对TAE术后肝功能的影响。

综上所述，TAE术后，兔VX2肝癌模型肝细胞缺血、缺氧，癌旁肝组织发生氧化应激，且癌旁肝组织中SOD、CAT、GSH-PX活性下降而产生的大量氧自由基使肝细胞凋亡进一步加剧，最终导致肝功能下降。本实验从活体动物水平观察氧化应激及细胞凋亡在肝组织损伤中的作用，有利于临床探寻能够安全、有效地减轻TAE术后肝损伤的方法。将SOD等抗氧化酶作为保护肝功能的靶点，通过激活酶促抗氧化系统清除过多的氧自由基，从而减轻TAE术后对肝功能的损害，有望成为今后临床研究的方向之一。