不同机械指数诊断超声联合微泡对裸鼠胰腺癌移植瘤化疗的影响

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(陆军军医大学第二附属医院超声科，重庆 400037)

超声化疗通过低强度超声激励造影剂微泡空化，暂时性开放血管壁、增加细胞膜通透性(声孔效应)，提高肿瘤局部化疗药物浓度，因有望逆转部分化疗抵抗而成为目前相关领域研究的热点[1-3]。利用诊断超声实施肿瘤超声化疗，兼具实时影像定位、能量低、安全性高、临床转化快等优点[4-5]。诊断超声调控微泡空化的最主要参数为机械指数(mechanical index, MI)。本研究建立裸鼠人胰腺癌荷瘤模型，分析不同MI条件下诊断超声联合微泡对肿瘤局部血流及化疗药物释放的影响。

1 材料与方法

1.1 模型建立及分组 选取4周龄雄性裸鼠45只[由陆军军医大学第二附属医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK(渝)20170002]，体质量10～12 g。将人源胰腺癌细胞系PANC-1细胞置于37℃、5% CO2孵化箱内，待细胞长至70%～80%融合面积时行胰酶消化处理。以1 000 rot/min转速离心5 min后，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline， PBS)重悬，调整细胞浓度为6×107～8×107/ml。采用无菌注射器分别于裸鼠双侧后腿内侧注射0.1 ml细胞悬液，成功建立裸鼠人胰腺癌荷瘤模型33只，约20天后触诊评估肿瘤大小，待肿瘤最大径0.5～1.0 cm时将其随机分为A、B、C组，每组11只。

1.2 化疗及超声处理 将荷瘤裸鼠按0.007 ml/g体质量腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉后，仰卧位保定于操作台，建立尾静脉通道。采用飞依诺VINNO 70彩色多普勒超声诊疗一体机，X4-12L浅表高频线阵探头，静脉团注0.02 ml脂氟显微泡造影剂(由陆军军医大学第二附属医院超声科自行研发，外层为磷脂外膜，核心气体为全氟丙烷，粒径2.0 μm，浓度2×109～9×109/ml)行超声造影。造影结束后，按0.010 ml/g体质量静脉缓慢推注1 mg/ml阿霉素(doxorubicin， DOX)。之后随机选取荷瘤裸鼠一侧后腿为治疗侧，行超声辐照；另一侧为对照侧，行超声假照。超声诊疗设备具有调控微泡空化的Vflash模式，可调节与微泡空化相关参数，主要包括MI、中心频率、脉冲宽度(pulse length, PL)、脉冲重复频率(pulse repetition frequency, PRF)和脉冲/间歇时间。对3组荷瘤裸鼠治疗侧均采用中心频率4 MHz、PL 18个周期、PRF 50 Hz，脉冲/间歇时间0.48 s/2 s进行辐照；A组MI 0.3，B组MI 0.7，C组MI 1.1。超声辐照时，探头距肿瘤表面1 cm，调整治疗ROI，使其包括肿瘤及周边0.5 cm范围组织(图1)后开始辐照，共辐照10 min。辐照/假照过程中，实时推注微泡(0.02 ml脂氟显微泡造影剂稀释于1 ml生理盐水，整个辐照过程共推注0.4 ml)。辐照后约10 min，待造影剂基本廓清后，再次行荷瘤裸鼠双侧后腿肿瘤超声造影。

1.3 DOX药物浓度检测 每组中任意选取10只荷瘤裸鼠，于超声辐照/假照结束后1 h，在充分麻醉情况下剪开裸鼠胸腔，充分暴露心脏，经左心室插入8号平头针至主动脉，缓慢灌注生理盐水，同时剪开右心房引流出灌注液，直至流出液变清亮后剪取裸鼠双侧后腿部肿瘤组织。将肿瘤组织标本置于1 ml高氯酸溶液中(浓度0.1 mmol/L)，采用Bertin Precellys 24型研磨细胞破碎仪，以6 000 rot/min速率匀浆5 s，间歇20 s，循环3次。于4℃条件下静放置30 min后，以 14 000 rot/min高速离心5 min，取上清液，萃取肿瘤内DOX。采用Waters 2475高效液相色谱仪测定肿瘤组织内的DOX药物浓度。

1.4 超声造影定量分析 分析超声辐照/假照前后造影图像，勾画包含整个肿瘤组织的ROI，通过时间-强度曲线获得峰值强度(peak intensity, PI)及AUC。

1.5 组织病理检查 对每组中DOX药物浓度检测后剩余的1只荷瘤裸鼠肿瘤组织标本进行取材，方法同前。将肿瘤组织标本固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋、切片、HE染色后，采用Olympus BX63正置荧光显微镜观察肿瘤组织结构改变。

1.6 MI对应峰值负压测定 超声辐照/假照前，采用ONDA薄膜水听器测量不同MI对应的峰值负压范围(探头单根线测量，取幅值最大的线)。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，采用配对t检验对各组治疗侧与对照侧、超声辐照/假照前与超声辐照/假照后进行比较；不符合正态分布则以中位数(上下四分位数)表示，采用Wilcoxon符号秩和检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织DOX药物浓度 A、B、C组治疗侧肿瘤组织DOX药物浓度分别为(1.45±0.53)μg/g、1.75(1.60，1.80)μg/g和1.13(0.65，1.33)μg/g，对照侧分别为(1.07±0.46)μg/g、1.76(1.72，1.78)μg/g和1.04(0.71，1.33)μg/g。A组治疗侧药物浓度明显高于对照侧(t=-5.163，P=0.001)；B组及C组治疗侧与对照侧药物浓度差异均无统计学意义(Z=-0.297、-0.357，P=0.766、0.721)。

2.2 超声造影定量指标 与超声辐照/假照前比较，A、B、C组辐照后治疗侧PI均升高、AUC均增大(图1)，A、C组假照后对照侧PI均升高，A组假照后对照侧AUC增大(P均<0.05)，见表1。

2.3 肿瘤组织病理表现 大体观察，A、B、C组肿瘤组织超声辐照/假照后均未见明显改变，瘤块呈淡黄色，质地坚韧，肿瘤中心未见明显坏死区域。HE染色后镜下观察见肿瘤组织主要由胰腺癌细胞和结缔组织构成，肿细胞呈索状排列，核大、深染，呈明显异型性，未见明显出血及细胞肿胀(图2)。

2.4 实测峰值负压 A组(MI 0.3)实测峰值负压0.81～0.83 MPa，B组(MI 0.7)为0.96～1.32 MPa，C组(MI 1.1)为2.29～2.53 MPa。

3 讨论

目前已有动物实验[6]及临床研究[7]证实低强度超声联合微泡可有效增强肿瘤化疗疗效,空化效应在其中起到关键作用。调控空化效应的目的是在提高肿瘤局部化疗药物浓度的同时，避免由其造成的不良反应，其中调节峰值负压尤为重要。峰值负压在诊断超声中主要以MI的形式呈现。Dimcevski等[8]利用MI为0.2的诊断超声联合微泡增强胰腺癌的化疗效果，使患者中位生存期延长8.9个月。Lin等[9]利用1.2 MPa低强度超声联合微泡增益荷瘤裸鼠化疗的实验结果也表明其有效提高了肿瘤局部药物浓度。

表1 各组裸鼠人胰腺癌荷瘤模型辐照前后超声造影定量指标比较(n=10)

图1 裸鼠人胰腺癌荷瘤模型超声造影表现，A组(MI 0.3) A.超声辐照/假照前裸鼠双侧后腿移植瘤超声造影图像，左侧为治疗侧，右侧为对照侧，白色圆形区域为ROI； B.超声辐照后超声造影示治疗侧(左侧)微泡灌注量较超声辐照前明显增多； C.ROI的时间-强度曲线

图2 裸鼠人胰腺癌荷瘤模型组织病理图(HE，×100) A、B.A组(MI 0.3)对照侧(A)及治疗侧(B)； C.B组(MI 0.7)治疗侧； D.C组(MI 1.1)治疗侧

超声化疗虽能增强肿瘤局部药物浓度，从而提高化疗疗效，但目前对超声辐照MI的选择缺乏统一标准。本研究中，选取3种不同MI的诊断超声联合微泡作用于裸鼠人胰腺癌荷瘤模型，发现当MI为0.3时，治疗侧肿瘤组织内DOX药物浓度较对照侧明显升高，提示在此条件下利用诊断超声联合微泡可显著提高化疗效果； MI取0.7和1.1时，治疗侧与对照侧DOX药物浓度差异均无统计学意义。既往研究[10-12]报道，微泡在血管内发生瞬态空化所对应的峰值负压阈值为0.5～1.0 MPa，峰值负压>2.0 MPa时，高强度的瞬态空化可使微血管壁发生机械毁损，导致肿瘤组织发生暂时性水肿，从而压迫阻断肿瘤血液循环，产生抑制肿瘤血流效应，反而不能促进肿瘤局部化疗药物释放。本研究中MI为0.3时对应实测峰值负压为0.81～0.83 MPa，此时超声能量已可使微泡在血管内发生瞬态空化，且不会引发因峰值负压高而产生的不良反应；MI为0.7时对应实测峰值负压为0.96～1.32 MPa，同样处于可激发瞬态空化的范围内，但在此条件下DOX药物靶向释放浓度较超声辐照/假照前并无显著提高，提示随峰值负压逐渐增高，瞬态空化所产生的生物学效应在空化效应中所占比例逐渐升高，稳态空化所占比例逐渐下降，肿瘤血流抑制效应逐渐增强；MI为1.1时对应的实测峰值负压为2.29～2.53 MPa，符合以瞬态空化为主的肿瘤血管抑制效应的发生条件。

肿瘤血管的异质性可能是影响肿瘤血管局部药物浓度的另一重要因素，主要体现在肿瘤血管结构和相关血流动力学方面[13-15]。肿瘤血管发育缺损时，较正常血管的组织结构更为薄弱。MI为0.3时，超声联合微泡作用于肿瘤血管，脆弱的血管可能产生更显著的声孔效应，从而提高肿瘤局部药物浓度。肿瘤血管血流动力学的异质性体现在肿瘤周边部位的血管与肿瘤中心的血管相比，血流量更大、流速更快，微泡浓度也更高，可产生更为显著的空化效应。随着超声能量升高，当MI≥0.7时，肿瘤周边部位血管内微泡迅速空化，造成局部组织水肿，对管壁更薄的肿瘤中心血管产生挤压，导致肿瘤中心血管内微泡空化更为困难，局部药物释放受到抑制，而这样的抑制作用可能是一过性或功能性的[16]。

本研究超声造影定量分析显示，治疗侧超声辐照后PI及AUC均较辐照前明显提升；对照侧超声假照后亦有一定提升，其中A、C组PI及A组AUC与超声假照前比较差异均有统计学意义。分析原因，可能是由于裸鼠体质量过低，实验中微泡及生理盐水推注量约0.6 ml，接近循环血量的60%(裸鼠循环血量约0.8～1.0 ml)，使得循环负荷显著增加，具体机制尚待进一步研究。

综上所述，MI=0.3的诊断超声联合微泡能促进人胰腺癌荷瘤裸鼠肿瘤局部化疗药物释放； MI≥0.7时无法有效提高肿瘤局部药物浓度。本研究未对峰值负压<0.5 MPa(对应MI<0.2)的超声联合微泡进行肿瘤局部化疗药物释放分析，将在今后进一步研究。