MicroRNA-449b-5p通过靶向KLF4促进肝细胞癌的增殖和转移

黄智平，郑浩，姚乃心，周伟平，倪俊声



MicroRNA-449b-5p通过靶向KLF4促进肝细胞癌的增殖和转移

黄智平*，郑浩*，姚乃心，周伟平，倪俊声

200433 上海，海军军医大学第三附属医院肝外三科（黄智平、郑浩、周伟平、倪俊声）；510010 广州，中国人民解放军南部战区总医院肝胆外科（黄智平）；200433 上海，海军军医大学基础医学院（姚乃心）

旨在探讨 miR-449b-5p 在肝细胞癌发病机制中的作用。

用miR-449b-5p 模拟物或miR-449b-5p 抑制剂转染肝细胞癌细胞系。通过CCK-8 和Transwell 实验鉴定miR-449b-5p 对肝细胞癌细胞增殖和迁移能力的影响。Western blot 和 qRT-PCR 检测miR-449b-5p 和KLF4 mRNA 的表达水平。采用双荧光素酶法验证miR-449b-5p 与KLF4 的关系。

研究结果显示 miR-449b-5p 在人肝癌组织和细胞系中的表达上调。此外，降低 miR-449b-5p 的表达抑制了肝癌细胞的增殖和迁移能力。机制方面，实验数据证明 KLF4 是 miR-449b-5p 在肝癌细胞中的直接作用靶点。同时，拯救实验证实过表达 KLF4 可以抵消 miR-449b-5p 促进肝癌细胞增殖和转移的能力。与此同时，研究结果表明细胞周期抑制剂 p21 在 HCC 细胞中异常下调，而降低 miR-449b-5p 表达后这种抑制作用被逆转。

研究结果表明 miR-449b-5p 可通过靶向 KLF4 促进肝癌细胞的增殖和转移。

miR-449b-5p； KLF4； p21； 肝细胞癌

肝细胞癌（HCC）是一种世界范围内最常见的、死亡率极高的原发性肝癌类型，尤其在亚洲、非洲和南欧发病率较高[1]。虽然一些导致肝癌发生的危险因素如乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染、酗酒等已经被确认，但是 HCC 发病的确切分子机制仍然知之甚少。因此，阐明与肝癌相关的分子机制将有助于肝癌临床治疗[2-4]。

MicroRNAs（miRNA 或 miR）属于非编码 RNA 家族，可对基因表达进行转录后调控，通过降解 mRNA 或终止翻译来抑制基因表达[5]。由于一个 miRNA 的序列可以与多个不同的 mRNA 分子碱基配对，因此使得 miRNA 家族成员能够调节整个人类基因组中高达三分之一的蛋白质编码转录本。研究证明 miRNAs 在多种恶性肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[5]。近年来，研究发现miRNA 在肝癌的发生和发展中同样发挥着重要作用[6]，但有关 miR-449b-5p 在肝癌中的表达情况和功能研究甚少。在本研究中，我们发现在肝细胞癌组织中 miR-449b-5p 的异常高表达与患者预后不良显著相关；因此，我们重点研究了miR-449b-5p 在肝细胞癌进展中的作用和相应机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 本研究收集了 2012 年 6 月到 2013 年 8 月在海军军医大学第三附属医院 行肝脏肿瘤全切除的 75 例患者中的肝癌组织标本，样本离体后立即在液氮中快速冷冻并储存在–80 ℃。所有组织标本（包括肝癌组织和邻近的非癌组织）同时制作用于实验。此外，所有患者都签订了书面知情同意书，所有实验经海军军医大学第三附属医院伦理委员会批准。人肝癌细胞系 Hep3B、Bel-7402、Huh7、SK-hep-1 和肝细胞系 LO2来源于上海中国科学院细胞库。

1.1.2 试剂和仪器 Eagle 培养基和脂质体 2000购自美国英杰生命技术有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；Trizol 试剂和miRNA 定量试剂盒均购自中国大连宝生生物技术有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；一抗抗体KLF4、p21 和 GAPDH 均购自美国Abcam 公司；KLF4 质粒购自上海吉凯生物技术有限公司；细胞计数试剂盒以及miR-449b-5p、mimic（模拟物）、inhibitor（抑制剂）和 NC（阴性对照）miRNA检测试剂盒均购自广州瑞博生物技术有限公司；双荧光素酶报告系统购自上海吉马生物制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 所有细胞系在 Dulbecco（杜尔贝科）改良的 Eagle 培养基中培养，该培养基加入10% 胎牛血清以及 1000 U/ml 青霉素和 100 μg/ml链霉素。在 37 ℃，5% CO2的条件下，将所有细胞置于加湿培养箱中孵育培养。

1.2.2 qRT-PCR Trizol 试剂用于从组织和细胞中分离总 RNA。根据说明书，使用miRNA 第一链合成和 miRNA 定量试剂盒检测 miR-449b-5p的表达。以 U6 和 GAPDH 作为内对照。最后应用 2–ΔΔCt方法计算结果。

1.2.3 蛋白免疫印迹法 使用 1 × SDS-PAGE 加样缓冲液将 HCC 细胞裂解并提取蛋白质。使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。在 10% SDS-PAGE 凝胶上分离等量的蛋白质，然后转移到 PVDF 膜上。用 5% 脱脂乳封闭 2 h 后，用抗体KLF4（1:500）、p21（1:500）和 GAPDH（1:3000）孵育细胞膜。

1.2.4 细胞转染 将miR-449b-5p、mimic（模拟物）、inhibitor（抑制剂）和 NC（阴性对照）miRNA根据说明以 100 nmol/L 的浓度通过脂质体 2000 转染到细胞中。KLF4 质粒（1 μg）也在 miR-449b-5p 模拟物存在或不存在的情况下通过脂质体 2000 转染到细胞中。在 48 h 内转染两次后，细胞被用于随后的实验中。用 qRT-PCR 和蛋白免疫印迹法检测转染效率。

1.2.5 细胞增殖试验 根据细胞计数试剂盒（CCK-8）说明书测定细胞增殖。将 10 μl CCK-8 溶液加入到 96 孔板内培养了0 ~ 4 d 的转染细胞（1 × 103个/ml）中，在37 ℃下孵育 4 h。用酶标仪检测 450 nm 处细胞的吸光度。

1.2.6 细胞迁移试验 本实验中的细胞迁移在 Transwell 室中测量。转染 2 d 后，细胞在无生长因子的 DMEM 中孵育，然后移入涂有明胶的 Transwell 室的上室。Transwell 室的下室填充600 μl 的 DMEM 培养基。细胞在 37 ℃孵育4 h，然后用 90% 乙醇固定，0.05% 结晶紫染色15 min。用棉花拭子轻轻刮去非移行细胞。在显微镜下确定迁移的细胞。

1.2.7 荧光素酶测定 本研究使用 QuikChange®定点突变试剂盒生成的 KLF4 3'UTR 突变体。采用 PGL3 荧光素酶报告载体构建 PGL3-KLF4-wt 质粒和 PGL3-KLF4-mut 质粒。然后，将 pGL3- B4GALT3-wt 或pGL3-KLF4-mut 与 miR-449b-5p 质粒及相应对照在细胞中进行共转染。48 h 后，采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-449b-5p 在肝癌组织和细胞系中上调表达

首先，通过qRT-PCR方法检测 miR-449b-5p 在 75 例肝癌患者肿瘤和癌旁组织中的表达水平。如图1A所示，与对应的癌旁组织相比，miR-449b-5p 在肝癌肿瘤组织中显著上调表达。此外，本研究还检测了 miR-449b-5p 在人肝癌细胞系 Hep3B、Bel-7402、Huh7 和 SK-hep-1 及正常肝细胞 LO2中的表达情况。与正常肝细胞 LO2相比，miR-449b-5p 在 Hep3B、Bel-7402、Huh7 和 SK-hep-1 细胞中的表达均有不同程度上调（图 1B）。综上所述，miR-449b-5p 可能在 HCC 发展过程中发挥促进作用。

2.2 降低 miR-449b-5p 表达可抑制肝癌细胞增殖和迁移能力

为了研究肝细胞癌中miR-449b-5p 的生物学功能，将anti-miR-449b-5p 转染至Hep3B 和Bel-7402 细胞中并通过qRT-PCT 检测转染效率，结果显示 miR-449b-5p 表达显著下调（图 2A）。MTT 检测结果显示，miR-449b-5p 被敲除后 Hep3B 和 Bel-7402 细胞增殖能力均显著被抑制（图 2B）。Transwell 实验证实，miR-449b-5p 被敲除后 Hep3B 和 Bel-7402 细胞系的迁移能力显著降低（图 2C）。这些结果表明，miR-449b-5p 可以促进 HCC 细胞增殖和迁移能力。

2.3 KLF4 是肝癌细胞中 miR-449b-5p 的直接靶点

通过 TargetScan 7.2 在线软件，预测到 KLF4 可能是 miR-449b-5p 的作用靶点（图 3A）。荧光素酶报告实验显示 miR-449b-5p 过表达会显著抑制 Hep3B 和 Bel-7402 细胞系中KLF4-3'-UTR-wt报告基因的荧光素酶活性，而对 KLF4-3'-UTR-mut 报告基因的荧光素酶活性没有作用（图 3B）。应用qRT-PCR技术证实，miR-449b-5p 模拟物和抑制剂对 KLF4 mRNA 的表达没有作用（图 3C）。此外研究结果证实，在 Hep3B 和 Bel-7402 细胞中增强 miR-449b-5p 会下调 KLF4 的蛋白质水平；而抑制 miR-449b-5p 则会增加 KLF4 的蛋白质水平（图 3D）。

图 1 miR-449b-5p 在肝癌组织和细胞中上调表达[A：RT-PCR 检测 75 例肝癌组织与癌旁组织中 miR-449b-5p 的表达，t检验，*P < 0.01 vs 癌旁组；B：检测人肝癌细胞系 Hep3B、Bel-7402、Huh7、SK-hep-1 和正常肝细胞 LO2（对照组）中 miR-449b-5p 的水平，t检验，**P < 0.001 vs 对照组]

Figure 1 miR-449b-5p is upregulated in human HCC tissues and cells [A: The expression of miR-449b-5p was measured in 75 human HCC tissues and adjacent normal liver tissues (normal) by qRT-PCR assay (*< 0.01 vs. normal); B: The levels of miR-449b-5p were examined in human HCC cell lines Hep3B, Bel-7402, Huh7, SK-hep-1 and the normal liver cell LO2(control) (**< 0.001 vs. control)]

图 2 降低 miR-449b-5p 表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力（A：转染 48 h 后，用 qRT-PCR 法检测细胞中miR-449b-5p 的水平，t检验；B：通过 CCK-8 检测在 0 ~ 4 d 检测细胞增殖，t检验；C：转染 48 h 后通过 Transwell 测定细胞迁移能力，以未转染的细胞为对照，t检验；*P < 0.01，**P < 0.001 vs 对照）

Figure 2 miR-449b-5p promotes the proliferation and migration of human HCC cells. Cultured Hep3B and Bel-7402 cells were transfected with miR-449b-5p inhibitor, or negative control (NC) [A: The levels of miR-449b-5p in cells were evaluated after 48 h of transfection using qRT-PCR; B: Cell proliferation was detected at 0 - 4 days via CCK-8 assays; C: Cell migration was measured after 48 h of transfection by transwell assay. Non transfected cells were used as the control (**< 0.001 vs. control)]

图 3 KLF4 是肝癌细胞中miR-449b-5p 的直接靶点[A：KLF4 的 3'-UTR 中 miR-449b-5p的预测结合位点；B：分析转染 KLF4-3'-UTR-wt（KLF4-wt）或KLF4-3'-UTR-mut（KLF4-mut）的细胞中荧光素酶活性，t检验，*P < 0.01，**P < 0.001 vs 对照；C：qRT-PCR 法检测 KLF4 在细胞中的表达；D：通过蛋白免疫印迹法检测 KLF4 在细胞中的表达]

Figure 3 KLF4 is the target of in HCC cells [A: The predicted binding site of miR-449b-5p in the 3'-UTR of KLF4; B: Luciferase activities were analyzed in the cells transfected with KLF4-3'-UTR-wt (KLF4-wt) or KLF4-3'-UTR-mut (KLF4-mut) (*< 0.01,**< 0.001 vs. control); The expression of KLF4 in cells was examined via qRT-PCR (C) and Western blot assay (D)]

2.4 miR-449b-5p 通过靶向 KLF4 调控肝癌细胞增殖和转移

为了探讨 KLF4 确实是 miR-449b-5p 促进肝细胞癌细胞运动的下游靶基因，将过表达 KLF4质粒转染入 Hep3B 和 Bel-7402 细胞（图 4A）。上调 KLF4 的表达削弱了 miR-449b-5p 对 Hep3B和 Bel-7402 细胞增殖能力的促进作用（图 4B）。同时，如图 4C 所示，miR-449b-5p 促进细胞迁移的能力也受到 KLF4 过表达的抑制。与此同时，蛋白印迹实验证实与正常肝细胞 LO2相比，Hep3B 和 Bel-7402 细胞中 p21（KLF4 的下游作用分子）表达下调，而 miR-449b-5p 抑制剂逆转了这种下调表达（图 4D）。以上结果表明，miR-449b-5p 通过靶向 KLF4 促进肝癌细胞的增殖和迁移。

3 讨论

许多研究证实 miRNA 在肝细胞癌中异常表达，如 miR-135a、miR-33a、miR-320a、miR-122、和 miR-31[8-12]。尽管 miRNA 在 HCC 中异常表达与肝癌发生密切相关，但 miRNA 调节肝细胞癌进展的潜在机制仍需进一步探讨。在本研究中，结果显示 miR-449b-5p 在 HCC 中异常上调，并且通过抑制 KLF4 促进肝癌细胞增殖和转移，提示 miR-449b-5p 可能在调节 HCC 进展中发挥积极作用。细胞恶性增殖和侵袭是导致人类肿瘤发生的主要原因[13]。本研究结果显示 miR-449b-5p可促进肝癌细胞的增殖和迁移能力，而降低 miR-449b-5p 的表达对肝癌细胞的增殖和迁移能力有明显的抑制作用。

KLF4 是 KLF 锌指转录因子家族的成员之一，在细胞分化和发育调控中起重要作用。研究证实KLF4 在多种类型的肿瘤中具有肿瘤抑制作用[14-15]。在肝癌中 KLF4 的表达在肝癌组织中显著低于对应的癌旁组织[14]。在此，本研究证明 KLF4 是 miR-449b-5p 的直接靶点，并且在 HCC 细胞中能被 miR-449b-5p 以转录方式抑制。值得注意的是，我们发现过表达 KLF4 逆转了 miR-449b-5p 促进肝癌细胞增殖和迁移的能力，提示 miR-449b-5p 可能直接通过靶向 KLF4 促进 HCC 细胞的增殖和转移能力。作为 KLF4 的下游靶点，p21 已被认为是细胞周期进程中的负向调控因子。研究表明，KLF4 通过直接靶向 p21 抑制细胞增殖和迁移[7]。据报道，p21 反式激活是由 KLF4 与其启动子结合所诱导的，从而有助于 p21 在细胞周期中的抑制作用[16]。本研究证实了 miR-449b-5p-KLF4 对肝癌细胞下游 p21 的影响。与正常肝细胞相比，肝癌细胞中 p21 的表达显著下调；相比之下，miR-449b-5p 抑制剂显著增加了 p21 的表达，与增强的 KLF4 水平相近，由此提示表明 miR-449b-5p 可通过调节 KLF4 活性以及下游 p21 活性来促进肝癌细胞的生长和侵袭。

图 4 miR-449b-5p 通过靶向 KLF4 调控肝癌细胞增殖和转移[A：蛋白印迹法检测 Hep3B 和 Bel-7402 细胞中 KLF4 的蛋白水平；miR-449b-5p 模拟质粒和 KLF4 质粒共转染后，检测细胞增殖（B）和迁移（C）；D：用qRT-PCR 和蛋白印迹法检测 Hep3B、Bel-7402 和 LO2细胞（对照组）中 p21 的表达水平；t检验，#P< 0.05，*P< 0.01，**P< 0.001 vs 对照]

Figure 4 miR-449b-5p increases HCC cells motility by targeting KLF4 [A: The protein levels of KLF4 were detected via Western blot in Hep3B and Bel-7402 cells transfected with KLF4 plasmid or negative control plasmid (s-Plas). After cotransfection with miR-449b-5p mimic and KLF4 plasmid, cell proliferation (B) and migration(C) were then tested; D: The level of p21 in Hep3B, Bel-7402, and LO2cells (control) was measured by qRT-PCR and Western blot assay;#< 0.05,*< 0.01,**< 0.001 vs. control]

本研究的创新之处在于，首次探讨了 miR-449b-5p 对肝细胞癌增殖和转移的影响及其分子生物学机制；通过生物信息学和分子实验学手段，我们确定 ZIK1 基因可能是 miR-449b-5p 的一个新作用靶点。我们的研究为揭示肝癌进展和转移的分子学机制提供了新的线索。但本研究也有一定的局限性，对于 miR-449b-5p 在肿瘤组织中异常高表达的分子学机制还缺乏研究，我们推测 miR-449b-5p 有可能受到某些肿瘤发生相关的转录因子调控从而介导其在肝癌肿瘤组织中异常高表达。下一步我们的研究重点是通过生物信息分析和分子学手段探索 miR-449b-5p 在肝癌肿瘤组织中异常高表达的分子机制。

综上所述，本研究为肝癌的发病机制提供了新的认识。上调的 miR-449b-5p 可通过靶向下游KLF4 和 p21 促进肝癌细胞的增殖和迁移，这可能为肝癌提供新的治疗靶点。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[2] Wei W, Du C, Lv J, et al. Blocking A2B adenosine receptor alleviates pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis via inhibition of IL-6 production and Th17 differentiation. J Immunol, 2013, 190(1):138-146.

[3] Honeyman JN, Simon EP, Robine N, et al. Detection of a recurrent DNAJB1-PRKACA chimeric transcript in fibrolamellar hepatocellular carcinoma. Science, 2014, 343(6174):1010-1014.

[4] Li Z, Tuteja G, Schug J, et al. Foxa1 and foxa2 are essential for sexual dimorphism in liver cancer. Cell, 2012, 148(1-2):72-83.

[5] Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 2005, 435(7043):834-838.

[6] Finch ML, Marquardt JU, Yeoh GC, et al. Regulation of microRNAs and their role in liver development, regeneration and disease. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 54(8):288-303.

[7] Lin H, Huang ZP, Liu J, et al. MiR-494-3p promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and human hepatocellular carcinoma progression by targeting PTEN. Sci Rep, 2018, 8(1):10461.

[8] Yao S, Tian C, Ding Y, et al. Down-regulation of Krüppel-like factor-4 by microRNA-135a-5p promotes proliferation and metastasis in hepatocellular carcinoma by transforming growth factor-β1. Oncotarget, 2016, 7(27):42566-42578.

[9] Tian C, Yao S, Li L, et al. Klf4 inhibits tumor growth and metastasis by targeting microRNA-31 in human hepatocellular carcinoma. Int J Mol Med, 2017, 39(1):47-56.

[10] Zhang Z, Li X, Sun W, et al. Loss of exosomal miR-320a from cancer-associated fibroblasts contributes to HCC proliferation and metastasis. Cancer Lett, 2017, 397:33-42.

[11] Han SY, Han HB, Tian XY, et al. MicroRNA-33a-3p suppresses cell migration and invasion by directly targeting PBX3 in human hepatocellular carcinoma. Oncotarget, 2016, 7(27):42461-42473.

[12] Wang G, Jia T, Xu X, et al. Novel miR-122 delivery system based on MS2 virus like particle surface displaying cell-penetrating peptide TAT for hepatocellular carcinoma. Oncotarget, 2016, 7(37):59402- 59416.

[13] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 2011, 144(5):646-674.

[14] Li Q, Yong G, Guo K, et al. Dysregulated krüppel-like factor 4 and vitamin D receptor signaling contribute to progression of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 2012, 143(3):799-810.

[15] Zhang N, Zhang J, Shuai L, et al. Krüppel-like factor 4 negatively regulates β-catenin expression and inhibits the proliferation, invasion and metastasis of gastric cancer. Int J Oncol, 2012, 40(6):2038-2048.

[16] Xu Q, Mei L, Ju Z, et al. Overexpression of KLF4 promotes cell senescence through microRNA-203-survivin-p21 pathway. Oncotarget, 2016, 7(37):60290-60302.

MicroRNA-449b-5p promotes proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma via targeting KLF4

HUANG Zhi-ping, ZHENG Hao, YAO Nai-xin, ZHOU Wei-ping, NI Jun-sheng

Third Department of Hepatic Surgery, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Naval Military Medical University, Shanghai 200433, China (HUANG Zhi-ping, ZHENG Hao, ZHOU Wei-ping, NI Jun-sheng); Department of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of Southern Theatre Command, Guangzhou 510010, China (HUANG Zhi-ping); College of Basic Medicine, Naval Military Medical University, Shanghai 200433, China (YAO Nai-xin)

This study was designed to explore the role of miR-449b-5p in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma.

HCC cell lines were transfected with miR-449b-5p mimics or miR-449b-5p inhibitor. Proliferation and migration were identified by MTT assay and transwell assay, respectively. Protein and mRNA expression levels of associated genes were measured by Western blot and quantitative real-time PCR (qRT-PCR), respectively. Dual luciferase assay was used to determine the relation of miR-449b-5p and KLF4.

We showed that miR-449b-5p expression was upregulated in human HCC tissues and cell lines. Decreased expression of miR-449b-5p inhibited the HCC cell proliferation and migration. KLF4 was identified as a direct target of miR-449b-5p in HCC cells. Furthermore, overexpression of KLF4 attenuated the effects of miR-449b-5p on the regulation of HCC cell motility. We also showed that the cell cycle inhibitor p21 was aberrantly downregulated in HCC cells, whereas this inhibition was reversed by miR-449b-5p inhibitor.

Our findings illuminated miR-449b-5p targeting KLF4 to promote the proliferation and metastasis in HCC cells.

miR-449b-5p; KLF4; p21; Hepatocellular carcinoma

NI Jun-sheng, Email: nijs77@me.com; ZHOU Wei-ping, Email: ehpwp@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.005

上海市卫计委青年基金（20164Y0189）；国家自然科学基金创新团体（81521091）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA21300）；上海市卫生和计划生育委员会科研课题青年项目（20154Y0083）

倪俊声，Email：nijs77@me.com；周伟平，Email：ehpwp@ 126.com

2018-10-29

*同为第一作者