GATA6和TPM1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

郝登荣，张宇祥



GATA6和TPM1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

郝登荣，张宇祥

718000 陕西，榆林市第一医院胸心外科（郝登荣）；716000 陕西，延安大学附属医院呼吸内科（张宇祥）

检测转录因子 GATA6 和原肌球蛋白 1（TPM1）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况，探讨两者在 NSCLC 中的临床意义。

选取在本院治疗的 NSCLC 患者 60 例，采用 PCR 技术检测 NSCLC 患者癌组织及对应癌旁组织中 GATA6 和 TPM1 基因表达情况，免疫组织化学法检测 GATA6 和 TPM1 蛋白表达，并分析 GATA6和 TPM1 表达水平与各临床病理参数的关系。Cox 回归模型分析 GATA6 和 TPM1 表达与 NSCLC 患者预后影响。

60 例 NSCLC 患者癌组织中 GATA6 基因表达水平及阳性表达率均明显高于癌旁组织，而 TPM1基因表达水平及阳性表达率均明显低于癌旁组织（< 0.05）。GATA6 和 TPM1 蛋白表达情况与患者年龄、分化等级、肿瘤分期、TNM 分期均无关系（> 0.05）；GATA6 蛋白表达情况与淋巴结是否出现转移密切相关（< 0.05），TPM1 的蛋白表达情况与患者病理分类密切相关（< 0.05）。GATA6 和 TPM1 以及是否出现淋巴结转移是影响 NSCLC 患者预后的主要危险因素（< 0.05）。

GATA6 和 TPM1 在 NSCLC 组织中呈异常表达，且是影响NSCLC 预后的危险因素，两者均在NSCLC 发生发展及预后评估中具有重要的意义，可为靶向治疗提供参考依据。

GATA6 转录因子； 原肌球蛋白； 癌，非小细胞肺

近些年，肺癌已成为发生率和死亡率均较高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者占 80%[1]。目前，随着肿瘤分子生物学研究的不断深入，转录因子、原肌球蛋白等的表达对人体各脏器肿瘤调控的报道逐渐增多。转录因子GATA6（GATA binding protein 6）是一种比较保守的转录调节因子，主要在脊椎动物肝脏、胰腺、心脏、肺、肠道、生殖腺等器官中表达，通过与其他组织的转录因子相互作用行使主要调控功能[2]。目前关于 GATA6 与各种肿瘤疾病的研究也逐渐开展。已有报道研究显示，GATA6 在多种肿瘤疾病中呈现异常表达，与多种肿瘤的发生及发展密切相关，且在不同肿瘤类型组织中发挥不同的生物学作用[3-5]。原肌球蛋白 1（tropomyosin-1，TPM1）在维持细胞正常状态，抑制细胞恶变中发挥重要作用，TPM1 的异常表达可能与多数肿瘤的发生发展有关[6]。但目前尚未发现有关 GATA6 和 TPM1 在 NSCLC 中表达情况的报道，本研究通过观察2013 年 3 月– 2015年 2 月收治的 60 例NSCLC 患者 GATA6 和 TPM1 的表达情况并分析其临床意义，旨在为 NSCLC 的诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 选择本院胸外科 2013 年 3 月– 2015年 2 月治疗的 60 例 NSCLC 患者为研究对象，其中鳞状细胞癌 29 例，腺癌 31 例；男 32 例，女 28 例；年龄在 43 ~ 75 岁之间，平均年龄（59.45 ± 9.04）岁；中、高分化 27 例，低分化 33 例；T1期 22 例，T2-3期 38 例；I ~ II期 24 例，IIIa~ IV期 36 例；无淋巴结转移者 32 例，有淋巴结转移者 28 例。此次研究经本院伦理委员会批准，患者及家属均自愿签署知情同意书。该60 例 NSCLC 患者术前和术后未进行化学治疗、放射治疗及免疫治疗，患者均有完整的临床资料和详细准确的诊断记录，所取组织均经过相关病理学认证，对照组癌旁正常组织距离病灶≥ 5 cm，无肿瘤细胞浸入。研究标本在离体半小时内用无菌纯化水清洗放于冻存管中，经液氮冷冻后保存在–80 ℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂与仪器 GATA6 抗体购自美国 Santa Cruz 公司；兔抗人 TPM1（alpha）抗体（ab55915）购自美国 Abcam 公司；反转录酶购自 Takara 公司；内参 GAPDH 购自上海康成生物工程有限公司；RNA 提取试剂盒购自北京天根生化有限公司；RT 试剂盒购自南京凯基生物有限责任公司；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂盒和 3,3-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Model550 型酶标仪和qRT-PCR 仪均购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 方法 ①总 RNA 提取：取组织，采用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，紫外分光光度计测定总 RNA 纯度并计算其浓度，总 RNA 纯度：1.65 <270/290< 2.0。②cDNA 合成：根据 RT 试剂盒说明书逆转录合成 cDNA。③引物设计与合成：所有引物热循环条件相同，反应体系均为20 μl，GATA6 上游引物 5' CTCAGT-TCCTACGCT TCGCAT 3'，下游引物 5' GTCGAGGTCAGTGAA CAGCA 3'；TPM-1 上游引物 5' GATACGAGGGA CCAAGTGC 3'，下游引物5' CTGGATGCGTCTGT TCAGAG 3'。④ PCR：PCR 反应条件为95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共扩增 35 个循环，最后 72 ℃ 10 min 延伸结束反应。PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分离，在 Tanon-4100 凝胶成像系统观察拍照[7]。

1.2.2 免疫组化方法 将石蜡切片常规脱蜡至水，枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复10 min，自然冷却至常温。擦干组织切片周围水分，加入体积分数为 3% 的 H2O2室温 10 min，用 PBS 冲洗干净，再加入一抗工作液（GATA6 和 TPM1 抗体均 1:100 稀释）2 ~ 8 ℃保存过夜，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，加入过氧化物酶标记的二抗液体，在 37 ℃的恒温箱孵育 30 min，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min，DAB 常温下显色，镜下控制反应时间，充分冲洗终止反应。苏木精复染胞核，染色 1 min，再用体积分数是 1% 的盐酸乙醇分色 3 s，脱水透明、封固，以 PBS 代替一抗作为阴性对照。由经验丰富的病理医师根据免疫组化染色的情况进行结果判定，在高倍显微镜下观察 2 组切片组织细胞着色深浅，以细胞浆或细胞膜出现黄至棕褐色颗粒为阳性显色，无着色0 分，淡黄色 1 分，棕黄色 2 分，棕褐色 3 分，阳性细胞密度分级为阳性细胞数≤ 10% 为 1 分，10% ~ 50% 为 2 分，> 50% 为 3 分，两项得分相乘结果≥ 3 分为阳性表达。

1.2.3 随访 对所有 60 例 NSCLC 患者进行全面回访记录，以手术当天为计数第 1 天，术后访问时间为 10 ~ 36 个月。术后生存期是手术当天至随访截止日期（2018 年 2 月）或患者死亡时间。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 GATA6 和 TPM1 mRNA 表达水平

NSCLC 患者癌组织中GATA6 mRNA 相对表达量高于癌旁正常组织，TPM1 mRNA 相对表达量低于癌旁正常组织（< 0.05），见表 1。

2.2 GATA6 和 TPM1 在 NSCLC 组织中的表达

免疫组化学结果显示，GATA6 蛋白免疫组化阳性主要表达于细胞核中，在癌组织中表达较多，而癌旁组织中表达较少；TPM1 蛋白免疫组化阳性主要表达于细胞质中，其在癌细胞中表达较少，而在癌旁组织中表达较多。NSCLC 患者癌组织中 GATA6 和 TPM1 阳性表达率分别为 85.00% 和 18.33%；在癌旁组织中 GATA6 无表达，呈阴性，TPM1 阳性表达率为 48.33%。与癌旁组织比较，癌组织中 GATA6 阳性表达率明显增高（< 0.05），TPM1 的阳性表达率明显降低（< 0.05），如表 2 及图 1、图2所示。

表 1 GATA6 和 TPM1 mRNA 表达水平

表 2 NSCLC 患者 GATA6 和 TPM1 表达情况

2.3 NSCLC 患者 GATA6 和 TPM1 的表达与临床病理特征关系

NSCLC 有淋巴结转移患者 GATA6 阳性表达率明显高于无淋巴结转移（< 0.05）。NSCLC 患者 GATA6 的表达与年龄、小细胞肺癌的病理分类、分化等级、肿瘤大小、肿瘤分期、TNM 分期没有明显关系（> 0.05）。TPM1 在鳞状细胞癌组织中的阳性表达率明显低于腺癌组织（< 0.05），TPM1 的表达在年龄、分化等级、肿瘤分期等临床病理特征上差异无统计学意义（> 0.05），详见表 3。

2.4 NSCLC 患者生存分析

对 60 例 NSCLC 患者进行 3 年随访记录，GATA6 高表达者 37 例，生存 21 例，累积生存率是 56.76%，低表达者 23 例，生存 19 例，累积生存率是 82.61%，NSCLC 患者 GATA6 高表达组的生存率显著低于 GATA6 低表达组（= 0.045），见图 3；TPM1 高表达者 40 例，生存31 例，累积生存率是 77.50%，TPM1 低表达者20 例，生存 9 例，累积生存率是 45.00%，NSCLC 患者 TPM1 高表达组的生存率显著高于 TPM1 低表达组（= 0.011），见图 4。

2.5 影响 NSCLC 患者生存率多因素 Cox 回归分析

利用 Cox 模型回归分析，患者年龄、病理分类、分化程度、淋巴结是否转移、GATA6 和 TPM1 的表达与 NSCLC 患者预后的关系，结果显示，淋巴结是否转移、GATA6 和 TPM1 表达是影响 NSCLC 患者预后的独立危险因素（< 0.05）（表 4）。

图 1 GATA6在癌组织（A）和癌旁组织（B）中的表达

Figure 1 Expression of GATA6 in NSCLC tissues (A) and paracancerous tissues (B)

图 2 TPM1 在癌组织（A）及癌旁组织（B）中的表达

Figure 2 The expression of TPM1 in NSCLC tissues (A) and paracancerous tissues (B)

3 讨论

目前肺癌已成为世界各国常见的恶性肿瘤之一，临床对肺癌的治疗仍是手术、放疗和化疗，大多数患者确诊时已是癌症晚期，生存率不足 20%[8-10]。肺癌按病理分型可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和 NSCLC，NSCLC 包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，它的癌细胞生长分裂慢，扩散转移现象发生较晚。NSCLC 的恶性肿瘤容易扩散转移至身体其他部位，治疗起来比较困难，患者预后较差，存活时间从几个月到几年不等，这主要取决于肺癌扩散速度和范围、病人自身条件及治疗方法的有效性。

GATA 家族是一类能够识别 GATA 基因序列并与该序列相结合的转录因子，分别是GATAl、GATA2、GATA3、GATA 4、GATA5 和 GATA6，结构上有 2 个典型的锌指核酸序列，可以结合氨基酸序列（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）[11]。GATA6 能增强尿激酶型纤溶酶原激活物的活化性，提高癌细胞侵袭和转移能力[12]。因此，在哺乳动物的大多数肿瘤细胞中常见到 GATA6 的表达增高。GATA6 基因位于人类 18 号染色体长臂 1 区 1 带 1亚带和 2 亚带中间 18q11.1-q11.2 区段，有 7 个外显子和 6 个内含子，但第 1 个外显子不编码蛋白。经过近些年的研究发现，GATA 系列的异常表达与肿瘤的发生、发展及预后有着十分紧密的联系。Tang 等[13]发现 GATA6 可以通过与半限制转录因子相互作用来调控机体细胞类型特化。Kwei 等[14]经过基因组表达谱分析发现，GATA6 是一个潜在的癌症相关基因，在胰胆管癌中高表达。本研究结果显示，NSCLC 患者癌组织中GATA6 mRNA 相对表达量及蛋白表达情况均明显高于癌旁正常组织，而在癌旁组织中 GATA6 蛋白无表达，呈阴性。有淋巴结转移患者 GATA6 阳性表达率明显高于无淋巴结转移，而与病理分类、分化等级、肿瘤大小、肿瘤分期、TNM 分期没有明显关系，此结果说明 GATA6 在 NSCLC 患者中呈现高表达情况，且可能参与 NSCLC 患者的侵袭转移。另外通过3 年随访结果显示，NSCLC 患者 GATA6 高表达组的生存率显著低于 GATA6 低表达组。Cox 回归分析也显示 GATA6 是影响 NSCLC 患者的危险因素。这些结果进一步说明，GATA6 不仅参与NSCLC 的发生发展，同时对评估患者预后情况也具有重要的作用。但是 GATA6 是否在小细胞肺癌的发生发展过程中也起到重要的作用还有待进一步研究，总之靶向 GATA6 等关键转录因子或调控基因在进行肺癌临床治疗时具有一定的参考价值。

表 3 GATA6 和 TPM1 的表达与临床病理特征关系

图 3 GATA6 表达与 NSCLC 患者生存期的关系

Figure 3 The relationship between GATA6 expression and survival of NSCLC patients

图 4 TPM1 表达与 NSCLC 患者生存期的关系

Figure 4 The relationship between TPM1 expression and survival of NSCLC patients

表 4 影响 NSCLC 患者生存率多因素Cox 回归分析结果

原肌球蛋白是在肌肉收缩过程中起着重要调节作用的蛋白，能够维持细胞运动和促使细胞凋亡，分布在各种真核细胞内[15]。在脊椎动物中 TPM 家族有 4 个成员（TPM1、TPM2、TPM3 和 TPM4），TPM1 属于高分子量组，负责细胞膜表面分子相互接触通讯，使得生长刺激信号能够在细胞与细胞之间传导，从而维持细胞的正常形态。Reumiller 等[16]证实，TPM1 基因能够表达出对大脑、细胞骨架等组织器官特异的异构体，可能影响这些特定组织器官的形成。还有研究发现，TPM1 表达可能会降低肿瘤的发生几率，乳腺癌、鼻咽癌和神经纤维瘤等肿瘤中 TPM1 表达明显低于正常组织，可能发挥着细胞转化抑制剂的作用[17-19]。李明娜等[20]认为，TPM1 在 NSCLC 组织中的表达量低于正常组织，具有较高的敏感性和特异性，推测 TPM1 的表达可能影响 NSCLC 的发生发展。而本研究结果也显示，TPM1 mRNA 相对表达量及蛋白表达情况均低于癌旁正常组织，同时TPM1 在鳞状细胞癌组织中的阳性表达率明显低于腺癌组织，TPM1 的表达在年龄、分化等级、肿瘤分期等临床病理特征上差异无统计学意义，此结果说明 TPM1 的表达对 NSCLC 的发生发展具有一定的影响。同时3 年随访结果显示，TPM1 高表达组的生存率显著高于 TPM1 低表达组，说明 TPM1 表达水平是影响 NSCLC 患者预后的危险因素。

综上所述，GATA6、TPM1 在 NSCLC 组织中 均呈现异常表达，且与临床病理特征有一定的关系，两者共同参与 NSCLC 的发生发展，且对评估患者预后也具有一定的作用。但是由于本研究仅检测了 GATA6、TPM1 的表达情况，关于其对疾病的内在作用机制并不明确，而且本研究样本量有限，所得结论是否符合临床实际情况还有待进一步深入研究。

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The expressions and clinical significances of GATA6 and TPM1 in non-small cell lung cancer

HAO Deng-rong, ZHANG Yu-xiang

Department of Cardiothoracic Surgey, The First Hospital of Yulin, Shaanxi 718000, China (HAO Deng-rong); Department of Respiratory Medicine, Yan'an University Affiliated Hospital, Shaanxi 716000, China (ZHANG Yu-xiang)

To investigate the expressions of transcription factor GATA6 and tropomyosin 1 (TPM1) in non-small cell lung cancer (NSCLC) and their clinical significances.

60 patients with NSCLC in our hospital were selected, PCR were used to detect the expressions of GATA6 and TPM1 in cancerous tissues and corresponding adjacent tissues of NSCLC patients, the expressions of GATA6 and TPM1 proteins were detected by immunohistochemistry, the relationships between the expression levels of GATA6 and TPM1 with clinicopathological parameters were also analyzed. Cox regression model was used to analyze the prognostic significances of GATA6 and TPM1 expressions in patients with NSCLC.

The expression level and positive rate of GATA6 gene in cancer tissues of 60 NSCLC patients were significantly higher than those in para cancerous tissues, while the expression level and positive rate of TPM1 gene were significantly lower than those in adjacent tissues (< 0.05). The expressions of GATA6 and TPM1 were not correlated with age, differentiation grade, tumor stage and TNM stage (> 0.05); the expression of GATA6 protein was closely related to lymph node metastasis (< 0.05), and the expression of TPM1 protein was closely related to pathological classification (< 0.05). GATA6, TPM1 and lymph node metastasis were the main risk factors for the prognosis of NSCLC patients (< 0.05).

GATA6 and TPM1 are abnormally expressed in NSCLC tissues, and are risk factors for prognosis of NSCLC. Both of them have important significances in the occurrence, development and prognosis evaluation of NSCLC, which can provide reference for targeted therapy.

GATA6 transcription factor; Tropomyosin; Carcinoma, non-small-cell lung

ZHANG Yu-xiang, Email: 503931453@qq.com

张宇祥，Email：503931453@qq.com

2018-09-13

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.011