抗寨卡病毒药物筛选模型的建立及其应用

周睿，石星，田东芳，张永欣，余利岩，马雪梅，李晓宇，岑山



抗寨卡病毒药物筛选模型的建立及其应用

周睿*，石星*，田东芳，张永欣，余利岩，马雪梅，李晓宇，岑山

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所（周睿、石星、田东芳、张永欣、余利岩、李晓宇、岑山）；100124 北京工业大学生命科学与生物工程学院（田东芳、马雪梅）

建立寨卡病毒抑制剂高通量筛选模型，为筛选和评价抗寨卡病毒化合物提供技术手段。

利用 CCK-8 法测定寨卡病毒感染后细胞活性，间接反应胞内病毒复制水平。进而对分析方法进行优化，建立可定量病毒复制能力的药物筛选模型，并利用统计学分析对模型的稳定性和灵敏性进行评价。应用该模型对 32 000 个微生物发酵液进行初步筛选，验证该方法的可行性。

成功建立寨卡病毒抑制剂高通量筛选模型，该筛选模型具有较好的稳定性和灵敏度，Z' 因子为 0.733，CV 为 5.52%，S/B 为 20.21，S/N 为 14.18。利用该模型筛选得到阳性样品 102 个，对其中I07A-01164进行抗病毒活性验证，测定其稀释 4 倍后可以抑制 50% 以上的病毒复制。

建立了抗寨卡病毒化合物的高通量筛选模型，可用于寨卡病毒抑制剂的筛选和活性初步评价，有助于抗寨卡病毒药物的发现。

高通量筛选分析； 抗病毒药； 寨卡病毒

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）属于蚊媒传播的黄病毒属病毒[1]，基因组为单股正链 RNA，全长约 11 kb，编码一个开放读码框（open reading frame，ORF）[2]，可形成一个多聚蛋白。寨卡病毒最早于 1947 年在乌干达恒河猴体内分离得到[3]。1952 年首次记录了人类感染寨卡病毒的病例[4]。2007 年在太平洋雅普岛出现了寨卡病毒疫情的爆发[5]。2016 年世界卫生组织（WHO）公布的数据显示，73 个国家或地区发生了寨卡病毒感染[6]。截至 2016 年 11 月 1 日，我国共报道 24 例寨卡病毒输入性病例。人感染寨卡病毒后，主要临床表现为皮疹、发热、肌肉酸痛、非化脓性结膜炎、头痛等[7]。此外，巴西寨卡疫情爆发后，越来越多的证据显示出寨卡病毒的感染与新生儿小头畸形存在密切关联[8]。由于寨卡病毒疫情严峻，并且没有特异针对寨卡病毒感染的治疗药物及疫苗，因此亟待研发抗寨卡病毒药物。

病毒感染宿主细胞后在胞内大量增殖，可导致细胞变圆和脱落，此现象被称为细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。寨卡病毒在其易感细胞 Vero E6 内扩增到一定程度将会导致细胞出现 CPE，细胞死亡，活细胞减少。通过测定寨卡病毒感染细胞的细胞活力，可以间接反映出细胞内病毒的增殖水平和感染性。

本研究中我们通过 CCK-8 法对寨卡病毒感染后的细胞活性进行检测，建立了一个简便、灵敏、稳定的定量分析寨卡病毒感染性的方法，并进而验证其作为寨卡病毒抑制剂高通量筛选体系的可行性。通过对 32 000 个微生物发酵液样品进行试验性的筛选，对筛选模型进行评价，结果证明该模型适用于抗寨卡病毒化合物的大规模筛选。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品 微生物发酵液粗提品由本所药用微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 细胞与病毒 非洲绿猴肾细胞（Vero E6）为本实验室自有；寨卡病毒（GenBank KF993678.1）由加拿大 McGill 大学梁晨教授惠赠。

1.1.3 主要试剂与仪器 DMEM 高糖细胞培养基和 RNA 提取试剂 Trizol均购自美国 Life Technologies公司；胎牛血清和磷酸盐缓冲液均购自美国 Gibco 公司；CCK-8 细胞活性测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；利巴韦林购自美国 Sigma 公司（货号 R9644）；逆转录酶 M-MLV 购自美国 Promega 公司（货号 M1701）；随机引物（货号 3801）和T 载体均购自日本 Takara 公司；寨卡病毒 NS3 抗体购自美国 GeneTex 公司（货号133309）；寨卡病毒 E 蛋白购自美国 Absolute 公司（货号 4G2）；β-actin 抗体购自英国 Abcam 公司；辣根酶标记山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；增强型化学发光液购自美国 Millipore 公司；PowerPacTMHC Power Supply 蛋白电泳仪、Mini Trans-Blot 蛋白转膜仪、凝胶成像仪均购自美国 Bio-Rad 公司；EnSpire 2300 多功能酶标仪购自美国 PerkinElmer 公司。

1.2 方法

1.2.1 寨卡病毒的制备 在细胞培养瓶中接种 Vero E6 细胞，在细胞汇合度达80% 左右时，按 MOI = 0.5 感染细胞。将细胞培养瓶置于 5% CO2、37 ℃恒温培养，待细胞病变度达 70% 左右收集细胞培养液上清。收集的上清 4 ℃、1000 ×离心 5 min，分装，–80 ℃冻存备用。

1.2.2 质粒构建 使用 Trizol 提取寨卡病毒 RNA，随后用随机引物进行逆转录。以病毒 cDNA 为模板，将编码寨卡病毒 NS2A 蛋白的基因克隆到 T 载体上。该质粒用以 RT-qPCR 绘制标准曲线，定量计算寨卡病毒基因组拷贝数。

1.2.3 细胞活性测定 使用 CCK-8 试剂盒测定细胞活性，具体方法参考产品说明书。感染病毒后 96 h，以无血清的 DMEM 更换细胞培养上清，并加入 10 μl CCK-8 试剂 WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]，于 5% CO2、37 ℃培养箱孵育 1.5 h，使用多功能酶标仪检测 450 nm 处光密度（）。

1.2.4 活性样品筛选 以微生物发酵液为筛选目标，寨卡病毒（MOI = 1）感染细胞后，直接加入待筛选的微生物发酵液 1 μl/孔。加入 1 μl DMEM 培养基为 Vero E6 细胞阴性对照（未感染病毒）；只感染寨卡病毒孔为病毒对照；感染病毒孔加入利巴韦林 80 μmol/L 作为阳性对照。

⑴SD 法：当测试样品数量较大时，计算样品 SD 与样品均值 SD 的离散程度，即（样品–平均值）/ SD（平均值），评价样品的抗病毒效果。

⑵抑制率法：病毒抑制率（%）=[1–（样品–无感染对照）/（病毒感染–无感染对照）]× 100%。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达 以 MOI = 1 感染 Vero E6 细胞，加入阳性发酵液 10 μl/孔，加入 DMSO 10 μl/孔为阴性对照，加入 80 μmol/L 利巴韦林作为阳性对照。感染后 48 h 加入胰酶消化细胞，800 r/min 离心 5 min，收集细胞。80 μl PBS 重悬细胞后加入 5 × 蛋白上样缓冲液 20 μl，裂解细胞。金属浴 100 ℃加热 30 min。SDS-PAGE 分离蛋白样品，然后 75 V 恒压湿法转膜 1 h。5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h。先后与一抗和二抗孵育，最后 ECL 显色。

1.2.6 病毒 RNA 提取和 RT-qPCR 根据Trizol 使用说明提取细胞的总 RNA。6 孔板中每孔加入 1 ml Trizol 溶液，收集细胞。室温静置 2 h 灭活病毒。取 2 μg RNA、2 μl 随机引物，根据 M-MLV 反转录酶说明进行逆转录。以逆转录的 cDNA 为模板，采用文献[9]报道的引物进行实时荧光 PCR 检测。利用寨卡病毒 NS2A 质粒，绘制标准曲线，对样品进行绝对定量。总体系 20 μl（10 μl SYBY Supermix，正反向引物各 1 μl，模板 cDNA 2 μl，RNase-free water 6 μl）。反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5s，60 ℃ 43 s，40 个循环。

1.2.7 基于 CPE 的 CCK-8 筛选模型的建立 将 Vero E6 细胞按照 5 × 105个细胞/孔接种至 6 孔板中，显微镜观察 Vero E6 细胞被寨卡病毒感染后的细胞形态变化。以 MOI = 0.01、0.1、1 和 10 感染 Vero E6 细胞后，提取细胞内总 RNA，利用 RT-qPCR 测定寨卡病毒基因组 RNA 表达水平。利用 CCK-8 方法分析寨卡病毒感染后细胞活性变化，以△值（未感染组–感染组）反映病毒感染对细胞活性的影响程度。

1.2.8 高通量筛选模型技术参数的优化 使用感染复数 MOI = 1 感染三种细胞密度（2500、5000、10000 个细胞/孔）下的 Vero E6 细胞，利用 CCK-8 实验检测病毒感染后 2、3、4 和 5 d 细胞活性大小。然后以感染复数 MOI = 0.5、1 和 2 感染 Vero E6 细胞，感染后 1、2、3 和 4 d 检测细胞活性。最终确定 Vero E6 细胞最佳的接种密度及感染复数。

1.2.9 抗寨卡病毒高通量筛选模型的评价 利用化合物利巴韦林对模型进行评价。Vero E6 感染寨卡病毒 24 h后，加入利巴韦林 0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，感染后 96 h 检测细胞活性。

1.2.10 阳性发酵液 EC50的确定 取处于对数生长期的 Vero E6 细胞，按5000 个细胞/孔接种于 96 孔板，24 h 后以 MOI = 1 感染 Vero E6 细胞，加入梯度稀释的阳性发酵液 1 μl，每个浓度设置 3 个复孔。96 孔板置于 5% CO2、37 ℃恒温培养 96 h 后 CCK-8 法测定细胞活性，计算阳性发酵液的 EC50。

1.2.11 CCK-8 法测定阳性发酵液对 Vero E6 细胞的毒性 取处于对数生长期的 Vero E6 细胞，按5000 个细胞/孔接种于 96 孔板，24 h 后加入梯度稀释的阳性发酵液 1 μl，每个浓度设置 3 个复孔，96 h 后 CCK-8 法测定细胞活性，计算阳性发酵液对 Vero E6 细胞的增殖抑制率。

1.2.12 数据分析 目前评价高通量筛选模型的统计学评价参数主要有 Z' 因子，变异系数（CV），信号噪音比（S/N）和信号背景比（S/B）。这些统计学评价参数可以对模型的灵敏度、有效性、重现性等作出评价。

2 结果

2.1 基于CPE 的 CCK-8 筛选模型的建立

Vero E6 细胞为寨卡病毒的易感细胞，病毒感染可引起细胞形态变化，因此本研究选用 Vero E6 细胞建立基于 CPE 的抗寨卡病毒药物筛选模型。如图 1A 所示，感染寨卡病毒的 Vero E6 细胞变圆、脱落、死亡。随感染复数的增加，病毒基因组拷贝数逐渐增加（图 1B）。同时，伴随着 CPE 的出现，病毒感染细胞的450测量值会逐渐下降，表明被感染细胞的活性明显下降。△值反映了病毒感染对细胞活性的影响程度，与病毒感染复数呈现良好的正相关关系（图 1C）。这表明通过细胞活性的测定间接反映了细胞内寨卡病毒的复制情况，可用于抗寨卡病毒化合物的筛选。

图 1 CCK-8 法判定病毒的感染能力（A：正常 Vero E6 细胞和寨卡病毒感染的 Vero E6 细胞；B：细胞内病毒基因组拷贝数；C：CCK-8 法测定细胞活性）

Figure 1 Measurement the infectivity of Zika virus by using CCK-8 (A: Vero E6 cells mock infected or infected with ZIKV; B: ZIKV mRNA copies in Vero E6 cells; C: Measurement of cell activity by CCK-8)

图 2 CCK-8 测量方法实验参数的优化（A：Vero E6 细胞接种细胞数的优化；B：感染复数的确定；C：CCK-8 试剂孵育时间优化）

Figure 2 Optimization of CCK-8 assay (A: Optimization of the seeded amount of Vero E6 cells; B: Determination of MOI; C: Optimization incubation time of CCK-8)

2.2 高通量筛选模型参数的优化

为了进一步优化分析方法的各项参数，考察了接种细胞数、病毒感染剂量和感染时间等对实验结果的影响。如图 2A 和2B 所示，接种 Vero E6 细胞5000 个/孔，细胞具有较好的细胞活性。当感染复数 MOI 等于 1 及以上，感染后 96 h 的病毒感染组细胞活性显著降低（图 2B）。细胞活性测定时，对 CCK-8 试剂孵育时间进行优化，结果显示（图 2C），孵育 1.5 h 时，2= 0.9736，处于较高的水平且吸光值在最佳范围 0.3 ~ 1.2。鉴于此，确定 96 孔板内每孔接种 5000 个 Vero E6 细胞，以 MOI = 1 感染细胞，细胞活性的检测时间为感染后 96 h，CCK-8 试剂的孵育时间为 1.5 h。

2.3 CCK-8 高通量筛选方法的验证与评价

为了初步评价 CCK-8 法是否可以定量分析抗寨卡病毒药物的活性，应用该方法分析了广谱抗病毒药物利巴韦林抑制寨卡病毒复制的量效关系。利巴韦林又名病毒唑，其通过抑制病毒RNA 依赖的RNA 聚合酶活性，从而发挥抗病毒活性。如图 3 所示，利巴韦林处理后可以抑制寨卡病毒在 Vero E6 细胞内的复制，EC50为 48.36 μmol/L。尽管测定的数值略高于文献报道的 5.2 μmol/L[10]。本实验结果证明了该分析方法可以定量分析样品的抗寨卡病毒活性，初步验证了其用于筛选寨卡病毒抑制剂的可行性。

Z' 因子是目前评价高通量筛选模型的主要统计学评价参数，能够同时反映信号的动态范围和数据变化的程度，当 Z' 因子在 0.5 ~ 1.0 之间时，该筛选模型可用于高通量药物筛选。本筛选方法的 Z' 因子为 0.733（图 4），符合高通量筛选的要求。同时，一个合格的筛选模型变异系数（CV）应小于 20%，信号噪音比（S/B）应大于 3 和信号背景比（S/N）应大于10[11]，此筛选方法的 CV 为 5.52%，S/B 为 20.21，S/N 为 14.18，表明该模型稳定、灵敏、特异。

图 3 利巴韦林的量效关系曲线

Figure 3 Dose-response relationship of the anti-ZIKV compound ribavirin

2.4 CCK-8 高通量筛选方法的应用

进而利用该高通量筛选方法，对 32 000 个微生物发酵液粗提样品进行筛选，通过计算样品相对的 SD 水平评价其抗寨卡病毒能力。当样品的相对 SD 值大于 3 时，判定为阳性结果。初筛结果如图 5A 所示，在初筛的 32 000 个样品中，阳性样品 102 个，阳性率 1%。

对筛选得到的阳性微生物发酵液I07A-01164进行了抗病毒活性测定，结果如图5B 和 5C显示，阳性发酵液处理后胞内病毒拷贝数下降 67%，Western blot 检测病毒蛋白也显著下调。该结果说明筛选到的阳性样品具有抗寨卡病毒活性，初步验证了该方法的可行性。

为了更准确地评价阳性样品的抗病毒活性，对阳性发酵液进行 EC50及细胞毒性的测定。结果如图 5D 所示，在较低的稀释度下阳性发酵液表现了明显的抗病毒活性，在稀释 4 倍时可以抑制 50% 以上的病毒复制。同时以 CCK-8 法测定阳性发酵液对 Vero E6 细胞的细胞毒性，阳性发酵液未表现出明显的细胞毒性。

3 讨论

目前，寨卡病毒抑制剂的研发刚刚起步，主要是围绕对已有药物的再利用。Barbosa-Lima等[12]通过对病毒感染后细胞内病毒 RNA的检测，分析抗疟药氯喹及其衍生物的抗病毒活性。Barrows 等[13]则利用免疫荧光法筛选了774 种FDA 批准的药物。但是这些筛选和分析方法均操作繁琐、较费时费力。

为了实现对抗寨卡病毒药物的高通量筛选，本研究建立了一个灵敏、稳定的高通量筛选模型，可定量分析寨卡病毒的感染性。实验测定的是病毒复制后对细胞产生的最终结果即细胞病变效应，方法直接可靠。当筛选的样品中存在抗寨卡病毒感染的活性成分时，可以保护细胞不出现 CPE，即与对照组相比，加入潜在抗病毒成分后细胞的活性更大，通过细胞活性的测定，找出潜在的具有抗寨卡病毒活性的化合物。研究表明，通过高通量筛选模型初步获得了 102 个具有抗病毒活性的微生物发酵液，并进一步验证了阳性样品的抗寨卡病毒活性。该结果初步验证了该筛选方法可用于寨卡病毒抑制剂的筛选和活性评价。同时利用 Z' 因子及阳性化合物的量效关系验证了该模型的稳定性和灵敏性。

图 4 CCK-8 筛选模型 Z'因子的确定

Figure 4 Determination of Z' factor of the CCK-8 assay

图 5 微生物发酵液初筛结果及阳性发酵液抗寨卡病毒活性验证（A：初筛结果；B：细胞内病毒基因组拷贝数；C：免疫印迹检测寨卡感染的Vero E6 细胞内病毒蛋白表达；D：阳性发酵液EC50）

Figure 5 The results of high-throughput screening and verification the anti-ZIKV activity of positive microorganism fermentation sample (A: Results of the pilot high-throughput screening; B: ZIKV mRNA copies in Vero E6 cells; C: Western blot analysis of viral protein in Vero E6 cells infected with ZIKV; D: EC50of positive microorganism fermentation sample)

本文的筛选方法是建立在细胞模型的基础上，因此在进行高通量筛选时，需严格控制实验体系中微生物发酵液加入量，否则产生的细胞毒性作用会影响活性成分抗病毒活性的评价。在检测微生物发酵液抗病毒活性的同时进行其细胞毒性作用的测定，保证抗病毒活性测定的结果真实、可靠。

综上所述，本文建立了抗寨卡病毒药物筛选模型，该模型简单、快速、稳定、可靠，可用于高通量筛选对寨卡病毒有抑制活性的样品。抗寨卡病毒药物筛选模型的建立有助于抗寨卡病毒药物的研发。

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Establishment and application of a high-throughput screening model for Zika virus inhibitors

ZHOU Rui, SHI Xing, TIAN Dong-fang, ZHANG Yong-xin, YU Li-yan, MA Xue-mei, LI Xiao-yu, CEN Shan

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (ZHOU Rui, SHI Xing, TIAN Dong-fang, ZHANG Yong-xin, YU Li-yan, LI Xiao-yu, CEN Shan); College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (TIAN Dong-fang, MA Xue-mei)

To establish a high-throughput screening (HTS) model for anti-Zika virus (ZIKV) compounds screening.

Using the CCK-8 assay, the viability of ZIKV infected cells were measured to monitor the replication of ZIKV. After optimization and validation of the screening model, the assay was used to screen 32 000 microorganism fermentation samples for the search of anti-ZIKV agents.

Biochemical experiments and the statistical analysis presented in this work demonstrate the qualification of the screening model with regard to sensitivity and reproducibility, and the Z' factor, CV value, S/B and S/N is 0.733, 5.52%, 20.21 and 14.18, respectively. Using this model, 102 positive samples were obtained, among which the antiviral activity of a positive fermentation sample (I07A-01164) was verified with inhibiting more than 50% of virus replication by four times dilution.

An ideal model is established for the evaluation of ZIKV inhibitors.

High-throughput screening assay; Antiviral agents; Zika virus

LI Xiao-yu, Email: xiaoyulik@hotmail.com; CEN Shan, Email:shancen@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.004

中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2018-I2M-3-004 SC）；国家重点研发计划（2016YFD0500307）

李晓宇，Email：xiaoyulik@hotmail.com；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2018-07-24

*同为第一作者