原因不明复发性自然流产患者外周血IL-6、let-7d-5p水平变化及其关系

谷兆琪，尹训强，王东梅， 张云虹，魏然，张振，朱肖肖，郭强，周宪宾，褚楚，赵霖，李霞

(1 济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250200；2 山东省医学科学院基础医学研究所；3 临沂市妇女儿童医院；4 山东中医药大学附属医院)

复发性自然流产(RSA)是指连续发生2次或2次以上的自然流产，育龄妇女发病率为3%～5%，占全部妊娠的10%～15%[1,2]。RSA病因复杂，除内分泌、解剖等因素外，约80%病因不明确，称为原因不明复发性自然流产(URSA)。URSA严重危害育龄妇女生殖健康，且患者再次发生流产概率随既往流产次数增加而升高，其发病机制及治疗是目前妇产科领域研究的重点与难点[3,4]。胚胎携带父方的遗传基因，相对于母体犹如同种异体移植；正常妊娠的建立与维持有赖于母胎免疫耐受的形成，免疫耐受状态的破坏将导致流产发生。随着生殖免疫研究的不断深入，细胞因子在母胎免疫耐受中的作用日益受到关注。研究发现，URSA患者血清白细胞介素6(IL-6)水平显著高于正常妊娠妇女，但导致这一现象的原因尚不清楚[5]。随着表观遗传学研究的不断深入，越来越多的微小核糖核酸(miRNA)被鉴定出来。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子。研究发现，其通过调控靶基因表达与功能进而参与了细胞增殖、分化与凋亡等生理过程，其表达异常参与了肿瘤、糖尿病、关节炎等多种疾病的发生与发展，但其在URSA中的作用与机制尚不清楚[6,7]。本研究通过检测URSA患者外周血IL-6及let-7d-5p水平变化，探讨let-7d-5p对IL-6是否存在调控作用，从表观遗传免疫调控角度阐释URSA发病机制，为临床治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年8月～2018年8月山东中医药大学附属医院妇产科门诊及病房就诊的正常早孕妇女和URSA患者。URSA患者入选标准[8]：①妊娠12周以内，有2次或2次以上自然流产史，无活产史；②夫妇双方和(或)胚胎染色体正常，无家族遗传病及近亲结婚史；③妇科白带检查、超声检查和(或)子宫输卵管造影等检查排除器质性病变、生殖器官解剖畸形及感染性因素；④月经周期正常，基础体温双相，超声监测排卵正常；⑤男方精液分析正常；⑥性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查均正常，自身抗体如抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗甲状腺抗体、抗2-糖蛋白Ⅰ抗体检查均呈阴性；⑦血栓前状态有关的检查，包括D-二聚体、纤维蛋白(原)降解产物、血凝系列、全血分析均正常；⑧Torch系列IgM均阴性；⑨以往未进行过主动免疫治疗。正常早孕妇女纳入标准：①妊娠12周以内正常妊娠查体妇女；②既往无自然流产、死胎、死产史，无遗传、解剖、内分泌方面异常，无感染、自身免疫性疾病史；③本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征；④超声证实胚胎发育正常，有心管搏动。共选取正常早孕妇女(正常妊娠组)和URSA患者(URSA组)各30例。URSA组年龄(27.8±4.4)岁、孕(7.5±1.3)周，对照组年龄(27.6±4.7)岁、孕(7.8±1.2)周，两组年龄与孕周具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 标本采集与试剂准备 受试者均于清晨空腹抽静脉血6 mL，离心法分离血清用于ELISA检测，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用于qPCR检测。主要试剂：人外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自索莱宝科技有限公司；IL-6 ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均购自北京康为世纪生物科技公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit购自东洋纺生物科技有限公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；let-7d-5p过表达(mimics：上游序列5′-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3′，下游序列5′-CUAUGCAACCUACUACCUCUUU-3′)、抑表达(inhibitor:5′-CTTGCCCTCTCCTCT-3′)、阴性对照(NC:上游序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游序列5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)及内参照U6逆转录引物与qPCR引物由上海吉玛公司设计合成，内参照GAPDH及目的基因IL-6 qPCR引物由上海博尚生物技术有限公司设计合成，引物序列见表1；野生型及突变型IL-6 mRNA 3′非翻译区(3′UTR)载体购自美国Promega公司。

表1 目的基因与内参基因引物序列及产物片段

1.3 外周血IL-6、let-7d-5p检测

1.3.1 IL-6 采用ELISA法。将1×洗液浸泡检测板30 s，按照说明书加入倍比稀释的标准品及样品。每孔加入检测抗体，混匀，室温孵育2 h，洗板6次；每孔加入稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，混匀，室温孵育45 min，洗板6次；每孔加入显色底物TMB避光，室温孵育15 min；按说明书每孔加入适量终止液，使用酶标仪进行450 nm、570 nm双波长下测定光密度(OD)值。绘制标准曲线后，依据OD450-OD570值计算IL-6浓度。

1.3.2 let-7d-5p 采用qPCR法。TRIzol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。根据miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成miRNA的cDNA，然后用UltraSYBR Mixture PCR反应体系进行扩增。以U6为内参照，根据获得数据采用2ΔΔCt法计算let-7d-5p的相对表达量。

1.4 let-7d-5p与IL-6关系的生物信息学预测与验证 通过差异基因的生物信息学分析，用Target Scan 7.1程序预测let-7d-5p与IL-6 mRNA的3′UTR是否存在结合位点。运用分子克隆技术，构建包含结合位点的野生型及突变型IL-6 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因pmirGLO载体；将293T细胞分为干预组和对照组，分别同时转染let-7d-5p(空白对照NC)与野生型或突变型IL-6 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因pmirGLO载体；转染24 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶报告基因活性。

1.5 let-7d-5p对IL-6表达的调控作用观察 将293T细胞分为3组，过表达组、抑表达组利用Lipofectamine 2000转染let-7d-5p mimics及inhibitor，空白对照组转染阴性对照引物；转染24 h后收集细胞，qPCR检测各组细胞中的IL-6 mRNA，ELISA检测各组培养上清液中的IL-6。①IL-6 mRNA：TRIzol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。根据ReverTra Ace qPCR RT Kit说明书合成mRNA，然后用UltraSYBR Mixture PCR反应体系进行扩增。以GAPDH为内参照，根据获得数据采用2-ΔΔCt法计算IL-6 mRNA的相对表达量。②IL-6：取各组培养上清液，检测方法同1.3.1。

2 结果

2.1 两组外周血IL-6及let-7d-5p水平比较 与正常妊娠组比较，URSA组血清IL-6水平升高而PBMC中let-7d-5p表达降低(P均<0.05)。见表2。

表2 两组外周血IL-6及let-7d-5p水平比较

注：与正常妊娠组比较，*P<0.05。

2.2 let-7d-5p与IL-6关系的生物信息学预测与验证结果 Target Scan 7.1程序预测显示，let-7d-5p与IL-6 mRNA的3′UTR之间具有潜在的碱基互补结合位点，提示let-7d-5p通过结合IL-6 mRNA 3′UTR进而抑制IL-6表达。见表3。双荧光素酶报告基因系统检测显示，与对照组比较，干预组能降低野生型 IL-6 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性(P<0.05)，但对突变型IL-6 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性无明显影响(P>0.05)。见表4。

表3 let-7d-5p与IL-6 mRNA 3′UTR结合位点预测

表4 let-7d-5p对IL-6 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性的影响

注：与对照组同型别比较，*P<0.05。

2.3 let-7d-5p对IL-6表达的调控作用 与空白对照组比较，过表达组细胞中IL-6 mRNA表达及细胞上清液中IL-6水平降低(P均<0.05)，抑表达组细胞中IL-6 mRNA表达及细胞上清液中IL-6水平升高(P均<0.05)。见表5。

表5 各组细胞中IL-6 mRNA表达及细胞上清液中IL-6水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

随着我国二胎政策的全面放开及妇女生育年龄的升高，URSA发病率呈上升趋势。这不仅严重影响妇女生殖健康，也给患者和家庭带来巨大压力。因此，URSA防治是临床亟待解决的难题。

母胎免疫耐受的形成是正常妊娠建立与维持的前提，细胞因子在其中发挥着复杂而精细的调控作用[9]。IL-6是目前研究较多的炎性细胞因子，主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞、纤维细胞及上皮细胞产生，妊娠期间绒毛膜细胞、羊膜及蜕膜细胞等亦可分泌[10]。IL-6能够诱导B细胞分化并促进T细胞增殖，介导急性炎症反应,在抵抗外界病原体感染和维持机体内环境稳定中具有重要作用，其表达与功能异常参与了炎症、肿瘤等多种疾病的发生与发展[11]。随着生殖免疫研究的不断深入，发现IL-6表达调控在母胎免疫耐受中发挥着重要作用，低水平IL-6状态对维持正常妊娠具有重要作用。URSA患者血清及局部母胎界面IL-6表达均显著高于正常妊娠妇女，本研究亦得出同样结论，提示IL-6在URSA中扮演了重要角色[12]。但是，导致URSA中IL-6表达升高的机制尚不清楚。因此，探索URSA中IL-6表达异常的根源,将进一步从生殖免疫角度阐释URSA发病机制，为临床治疗提供新的靶点。

随着测序技术的发展和人类多个基因组计划的完成，大量非编码RNA被鉴定出来，越来越多的研究发现这些曾经因不能编码蛋白质而被称为基因组中的“暗物质”或“垃圾RNA”在许多生命活动过程中扮演了重要角色。非编码RNA表观遗传研究是近期最热的生物学课题之一，层出不穷的研究结果不断地刷新着人们对非编码RNA的认识。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA，由细胞内源产生的发夹结构转录本加工而来。其主要与起靶基因3′UTR结合，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNA而调节基因的表达与功能，在细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥着重要作用，其表达异常参与了肿瘤、动脉粥样硬化等病理过程[13，14]。研究发现，miRNA调控其靶基因表达与功能在妊娠中具有重要作用，miRNA基因多态性及表达异常参与了URSA的发生与发展，但miRNA调控IL-6在URSA中的研究尚未见报道[15,16]。

let-7d-5p是长度为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA，其编码基因位于人的第9号染色体。有研究报道，let-7d-5p参与了Toll样受体信号通路调控，在乙肝病毒感染中其表达显著降低，但其在妊娠及妊娠相关疾病中的作用尚不清楚[17]。本研究发现，与正常妊娠组比较，URSA作用外周血PBMC中let-7d-5p表达水平明显降低，提示let-7d-5p参与了URSA发生。通过Target Scan生物信息软件预测，我们发现let-7d-5p与IL-6 mRNA的3′UTR之间具有潜在碱基互补结合位点，提示let-7d-5p通过结合IL-6 mRNA 3′UTR进而抑制其表达。

本研究通过双荧光素酶报告基因系统检测，进一步证实let-7d-5p与IL-6 mRNA 3′UTR存在碱基互补结合，提示let-7d-5p通过结合IL-6 mRNA 3′UTR进而调控其表达与功能。我们在293T细胞中转染let-7d-5p mimics，发现IL-6 mRNA及蛋白表达水平均提示let-7d-5p能够抑制IL-6表达；同时，发现在293T细胞中转染let-7d-5p inhibitor后，IL-6 mRNA及蛋白表达均显著升高，证实let-7d-5p对IL-6具有负向调控作用。

综上所述，本研究从表观遗传免疫调控角度揭示了let-7d-5p表达降低上调IL-6表达打破母胎免疫耐受状态导致URSA的机制，靶向调控let-7d-5p调节IL-6表达可能为URSA治疗的有效靶点与途径。