中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）检测性能验证

文/蔡爱华 李启平 陈丽娟 李静沛 李伟华

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）是一类小分子分泌型糖蛋白，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员，由Kjeldsen 等在1993年研究发现而确定[1]。近年来，随着人们对NGAL 进行深入研究，通过大量动物试验和临床试验证明NGAL 含量变化与肾脏疾病、心血管疾病、糖尿病、炎症等都有着密切的联系，特别是肾损伤领域，能迅速灵敏地反映肾损伤的程度及恢复过程，已成为一种新的早期急性肾损伤的敏感标志物[2]，且有望成为评估心血管疾病、预测不良心血管事件的新型评价指标[3]。因此稳定、快速和简便的NGAL 检测方法在临床诊断中至关重要，据现有文献报道，NGAL 检测方法主要有蛋白质印迹法、聚合酶链反应、化学发光法、酶联免疫吸附法和免疫组化法等方法[2]，各种方法均有优缺点，其中免疫组化法中的免疫比浊法是近年来出现的一种操作简单、灵敏度高、无污染，能够在全自动生化仪上实现大批量自动化检测的方法，满足临床应用。

依据《医学实验室质量和能力认可准则》的要求[4]，本研究采用胶乳免疫比浊法测定NGAL含量，对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒进行了方法学评价和检测性能验证。采用NGAL 试剂盒和日立7180 全自动生化分析仪组成检测系统用于临床检验，对其精密度、线性、正确度、抗干扰能力进行研究验证，为临床常规检测提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

日立7180 全自动生化分析仪，Milli-Q 超纯水机，梅特勒-托利多移液器。

1.2 试剂

实验所需试剂材料由试剂厂家提供：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）（Lot：20180209、20180217），配套校准品（Lot：20180209、20180217）；高值质控品（Lot：20180209）、低值质控品（Lot：20180209）；正确度回收试验人源样本和标准溶液样本；干扰物质为胆红素、维生素C、乳糜微粒、肝素钠。

2 方法

2.1 检验方法

2.1.1 检测原理

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）与胶乳颗粒包被的抗人NGAL 抗体结合，发生凝聚反应产生浊度，其浊度与样本中的NGAL 含量成正比，因此可以用浊度来计算样本中NGAL的浓度。

2.1.2 实验条件

两点终点法（+），主波长546nm，反应温度37 ℃，比色杯光径1cm，R1 160μl，样本量3μl，混匀，孵育5min，加R2 40μl，混匀，反应20～30s 后 读取吸光度A1，4min 后读取吸光度A2，计算吸光度变化值，并根据吸光度变化值计算得出样本中NGAL 的浓度。

2.1.3 校准程序

采用厂家试剂盒配套校准品多点校准，采用非线性法校准处理。

2.1.4 统计学处理

数据采用SPSS16.0 统计分析软件、Excel 2010 进行处理分析。评价线性和相关性是采用相关与回归分析。

2.2 精密度试验

依据CLSIEP5-A2[5]的文件要求，在室内质控，保证重复性条件下，分别以质控高值（283ng/ml）和质控低值（10ng/ml）为样本，测定2 个不同批号试剂盒，每个批号测试2 次，连续测试20日，计算2 个浓度质控品的重复性估计值和实验室内不精密度。

2.3 正确度回收试验

选择低浓度的人源样本，重复测定3 次，计算平均值；在人源样本中加入标准样本溶液（人源样本与标准溶液样本体积比为9：1），重复测定3 次，计算回收率。

表1 精密度试验结果

2.4 线性试验

用接近线性范围下限的低值样本（10ng/ml）稀释接近线性范围上限的高值样本（3500ng/ml），混合成6 个稀释浓度，范围在10～3500ng/ml 间。分别测试以上样本，每个样本重复测定3 次，求出每个稀释浓度测定结果的均值。以理论值为自变量，以实测均值为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r）。

2.5 干扰试验

参考CLSI EP7-A2[6]文件要求进行抗干扰试验验证，将血清与一定量干扰物（胆红素、维生素C、乳糜微粒以及肝素钠）充分混匀，对照样本中加入等体积的生理盐水，分别测定3 次，计算平均值，并与预期值进行比对，以干扰程度10%作为最高限，胆红素系列干扰浓度为200、150、100、50μmol/L，维生素C 系列干扰浓度为0.5、0.4、0.3、0.2g/L，乳糜微粒系列干扰浓度为0.5%、0.4%、0.3%、0.2%，肝素钠系列干扰浓度为50、40、30、20IU/ml。

3 结果

3.1 精密度试验

精密度试验结果如表1所示，所得重复性估计值和变异系数值均低于厂家规定的不精密度，符合要求。

3.2 正确度回收试验

正确度回收试验结果如表2所示，所得回收率为96.01%，满足厂家规定的85%～115%间，符合要求。

3.3 线性评估结果

以理论值为X 轴，以实测均值为Y 轴，求出线性回归方程为y=1.0798x+11.7399，相关系数（r）=0.9996。结果表明，此法测定NGAL 在10～3500ng/ml 范围内线性良好。

3.4 干扰试验结果

加入干扰物与没有加入干扰物的样本结果比对显示：胆红素≤200μmol/L，维生素C ≤0.5g/L，乳糜微粒≤0.5%， 肝素钠≤50IU/ml 时，对于测定NGAL无影响，符合标准要求，满足临床需求。

4 讨论

NGAL 作为一种新型的分泌蛋白，与肾脏存在着密切的关系[7]，其水平的升高主要是由于肾脏受到损伤刺激时肾小管大量分泌NGAL，因此，NGAL 含量的改变直接反映了肾脏的损伤程度[8]，且先于肌酐、半胱氨酸蛋白抑制剂等其他肾损伤标志物发生变化，是最具有应用前景的早期肾损伤标志物[9]。

近几年，随着新技术、新方法的不断应用，传统方法已经不能满足临床快速有效的检测要求，所以一些新的检测方法不断更新，大部分方法具有一定局限性，存在操作繁琐、检测灵敏度低、测定线性范围较小、只能单一检测尿液或者血浆、检测成本较高且需要特定仪器等不同问题[2]。本研究采用胶乳免疫比浊法在全自动生化分析仪上检测，可以同时测定血样和尿样，检测时间只需10min，且能满足临床实验室快速、大批量自动化检测的要求。通过方法学验证，本法在全自动生化仪上检测NGAL 含量有如下特点：①方法稳定，②重复性良好，③线性范围宽且具有良好线性，④正确度回收率高，⑤抗干扰性能良好，能较好地满足临床要求。

表2 正确度回收试验结果

综上所述，本文采用免疫比浊法在日立7180 全自动生化分析仪上对NGAL 进行检测，正确度、可重复性及稳定性好，操作简单全自动，检验快速，此法在临床上检测NGAL 浓度准确高效。目前 NGAL 检测也尚未有统一的检测方法，本文对NGAL 检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）与日立7180 型全自动生化分析仪组成的检测系统进行验证，为各实验室选择适合于本实验室的最佳检测方法提供更准确的依据，以更好地应用于临床。