2-DG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒标记人脐带间充质干细胞可行性观察

卢超，单秀红，熊非，顾宁，陈芹

(1江苏大学附属人民医院，江苏镇江 212002；2东南大学生物科学与医学工程学院)

间充质干细胞(MSCs)是一类来源于中胚层的多能干细胞，具有特异向多种肿瘤及其转移灶归巢迁移的能力。目前，MSCs向肿瘤定向迁移的确切机制尚不十分清楚，MSCs促进或抑制肿瘤增殖亦存在争议[1]。选择合适的方式对MSCs标记、示踪，在活体内检测细胞的迁移、增殖、分化等状态，有助于解决上述问题。超顺磁性氧化铁(SPIO)为磁共振成像(MRI)阴性对比剂，国内外报道将商用SPIO如Feridex标记MSCs进行体内外示踪研究，然而SPIO需要借助转染剂如多聚赖氨酸等标记细胞，但转染剂可影响细胞活力及分化能力[2]。本研究将2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)修饰的SPIO(γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs)直接标记人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)，观察其标记效率，并观察其对细胞活性、迁移能力的影响及体外磁共振成像，为磁标记hUCMSCs的MRI活体示踪奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 二巯基丁二酸(DMSA)购于上海贝合化工有限公司，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购于美国Pierce Chemical有限公司，D-氨基葡萄糖盐酸盐购于德国Alfa Aesar GmbH&Co KG公司，透射电镜(JEM-2000EX)购于日本JEOL公司，红外光谱检测仪购于美国Nicolet公司。

1.2 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs的制备与鉴定 采用化学共沉淀法合成γ-Fe2O3NPs，将100 mg γ-Fe2O3溶于10 mL氯仿，再加入50 μL三乙胺。将50 mg DMSA溶于10 mL二甲基亚砜，然后添加到γ-Fe2O3溶液。将混合液保持60 ℃振荡12 h，形成黑色沉积物γ-Fe2O3@DMSA NPs。将1 mL EDC和1 mL NHS、8 mL双蒸水分别加入10 mL γ-Fe2O3@DMSA NPs，室温下反应30 min，加入10 mL D-氨基葡萄糖盐酸盐，2 h后，用双蒸水对溶液进行透析纯化，形成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs样品。通过透射电镜观察纳米粒子形态，计算其平均粒径。采用红外光谱检测仪观察粒子表面结构。最终成功合成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs，该纳米粒呈近球形，粒径10 nm；水合粒径为(156.2±28.2)nm。饱和磁化强度为49.67 emu/g，Zeta电位为(-10.22±0.81)mV。红外光谱图示γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs出现C—N伸缩振动峰(1 107/cm)。纳米粒涂层DMSA与2-DG的结合率约为60%(羧基∶2-DG=10∶6)。

1.3 hUCMSCs的分离、培养 健康新生儿脐带取自江苏大学附属人民医院妇产科足月剖宫产的胎儿，其获取得到了医院伦理委员会的批准和患者的知情同意。将脐带用生理盐水冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，将剥离的华氏胶组织剪碎至1 mm3大小，加入低糖DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。培养液中含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。组织块贴壁后1周可见组织块周围爬出细小梭形细胞；14 d时细胞贴满瓶底，此时呈漩涡状、辐射状或网状排列。传代后细胞生长迅速，呈梭形或成纤维状，3 d可传1代。

1.4 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs体外标记hUCMSCs的效率测算 采用普鲁士蓝染色。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下，将hUCMSCs置于γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs铁浓度分别为0、8、16、32、64、128 μg/mL的含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液连续孵育24 h，以未与纳米铁孵育(铁浓度为0 μg/mL)的细胞作为对照组。将磁标记hUCMSCs接种于12孔板，吸取上清，用PBS洗涤3次，以4%多聚甲醛固定10 min，加入等量10%亚铁氰化钾、20%盐酸混合液，30 min后双蒸水冲洗3次，核固红复染15 min，再用双蒸水充分清洗。于显微镜200倍镜下观察，hUCMSCs细胞核呈红色，纳米铁呈蓝色位于细胞内，表明标记成功。任意选取5个视野，标记率=总标记细胞/总视野中所有细胞×100%。

1.5 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs细胞活力检测 采用CCK-8法。取第3代hUCMSCs按2 000个/孔接种96孔板，待细胞贴壁后，将梯度铁浓度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(0、8、16、32、64、128 μg/mL)培养基与细胞孵育24 h后弃上清液，PBS清洗3遍，每孔加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液100 μL及10 μL CCK-8试剂，置于温箱孵育2 h，于450 nm波长测量OD值。每个浓度设3个复孔，以铁浓度0 μg/mL为对照组，空白组仅含低糖DMEM培养液及CCK-8试剂，取全部结果的平均值。细胞活力(%)=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.6 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs迁移能力检测 采用Transwell迁移实验。将梯度铁浓度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(8、16、32、64、128 μg/mL)培养基与细胞孵育24 h后将hUCMSCs细胞制成单细胞悬液，细胞计数，离心后弃上清，用含1%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为1×106个/mL。取24孔板，向孔中铺入三阴性乳腺癌细胞BT549，待细胞贴壁融合80%时，吸弃上清，加入600 μL含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，然后将Transwell小室放入孔中。取上述磁标记hUCMSCs细胞悬液200 μL分别加入已备好的不同小室中，将24孔板置于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育24 h。随后甩去上层液体，PBS清洗小室，用湿棉签轻轻擦拭除去小室膜上层的细胞，多聚甲醛固定10 min后，普鲁士蓝染色30 min，伊红复染20 min，200倍镜下取上下左右中5个视野计数细胞个数。

1.7 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs细胞群MRI成像观察 将梯度铁浓度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(8、16、32、64、128 μg/mL)培养基与hUCMSCs连续孵育24 h，吸去培养基，用PBS洗涤3次，胰蛋白酶消化，将4.2×105个细胞均匀混悬于0.5%琼脂糖中固定，置于EP管中，其中铁浓度0 μg/mL为对照组。采用Siemens Avanto 1.5T MR扫描仪，相控阵8通道头线圈，轴位T2WI采用TR 5 500 ms，TE 100 ms，层厚2 mm，矩阵256×256，观测图像信号变化。采用自旋多回波脉冲序列(TR=3 000 ms，TE=22～352 ms，16个回波，矩阵256×256，层厚3 mm)，将图像传输到MRI系统配备工作站，生成T2图，选择3个大小一致的感兴趣区测量横向弛豫时间(T2)，取均值，计算横向弛豫率(R2)，R2=1/T2。

2 结果

2.1 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs体外标记hUCMSCs的效率 铁浓度为8、16、32、64、128 μg/mL时，hUCMSCs标记率分别为80.74%、90.80%、96.91%、99.56%、99.58%，细胞内蓝染颗粒数量随铁浓度升高而逐级增加。

2.2 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs细胞活力 空白组、对照组及8、16、32、64、128 μg/mL铁标记hUCMSCs OD值分别为0.163±0.005、0.291±0.011、0.277±0.007、0.273±0.024、0.274±0.004、0.276±0.008、0.273±0.003。8、16、32、64、128 μg/mL铁标记hUCMSCs细胞活力分别为90.5%、87.3%、88.1%、89.7%、87.3%，各铁浓度标记细胞活力与对照组比较差异均无统计学意义。

2.3 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs迁移能力 对照组及8、16、32、64、128 μg/mL铁标记hUCMSCs迁移细胞数分别为(151.4±9.89)、(141.4±5.55)、(154.6±4.83)、(152.4±7.77)、(150.6±8.38)、(47.8±2.28)个，128 μg/mL铁标记细胞与对照组相比P<0.01。

2.4 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs标记hUCMSCs MRI检测结果 对照组及8、16、32、64、128 μg/mL铁标记hUCMSCs T2图测的T2值分别为(115.83±2.24)、(88.70±1.97)、(82.87±1.52)、(80.70±0.78)、(62.36±1.70)、(52.50±1.65)ms，各浓度铁标记细胞T2值与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。相关性分析显示，hUCMSCs细胞群R2值与培养基γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs铁浓度呈正相关(r=0.964，P<0.05)。

3 讨论

MSCs可以定向迁移至靶组织，如损伤、炎症及肿瘤部位。SPIO与MRI成像相结合能够标记和示踪MSCs。hUCMSCs取材方便、无免疫排斥、分化能力强，本研究探讨利用2-DG标记的SPIO孵育hUCMSCs，在有效磁标记hUCMSCs的前提下，最大程度维持hUCMSCs的活力和迁移能力。

SPIO的生物相容性及摄取同纳米直径和表面特性相关[3]。本研究中SPIO核心为γ-Fe2O3，水合粒径为156 nm，表面修饰物DMSA不影响细胞活力，与细胞具有良好的亲和性[4]，可增加SPIO在细胞中的吸收[5]。同时包被DMSA的纳米铁进一步标记葡萄糖类似物2-DG，借助靶向配体2-DG与细胞膜葡萄糖转运蛋白(GLUT)的特异性结合，增强了受体介导的胞吞。前期研究显示，2 h内，γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs可被高葡萄糖代谢的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞[6]、前列腺癌PC3细胞[7]靶向吸收。本研究显示，无需借助转染剂，该纳米铁24 h可被hUCMSCs有效吸收，当铁浓度为32 μg/mL时，hUCMSCs标记率即可近97%。

研究[8]表明，适当浓度下SPIO标记MSCs后不会对细胞活力、增殖及分化能力造成明显影响。理想状态下，细胞内铁含量越高，磁共振信号变化越大。然而，安全标记浓度条件下，细胞内铁负重可影响细胞迁移能力，进而影响活体成像的追踪观察。本研究显示，2-DG标记的纳米铁在8～128 μg/mL铁浓度条件下，细胞活力均未见显著性降低。MSC特异性迁移到靶器官，需跨越血管内皮细胞和细胞外基质。hBMSCs穿过骨髓内皮细胞时，hBMSCs在形态上展开并伸出伪足，以足丝状突起的形式钻进内皮细胞。悬浮的MSCs的平均直径为15～19 μm[9]，本研究中Transwell膜孔径为8 μm，上室中的磁标记hUCMSCs穿过小孔到达下室，模拟了体内MSCs跨内皮细胞游出内皮的过程。本研究结果显示，当培养液铁浓度为128 μg/mL时，hUCMSCs迁移能力显著下降。

在不影响细胞迁移能力的前提下，hUCMSCs细胞内SPIO含量越高，T2驰豫时间缩短越明显，即MRI T2信号差异越大。SPIO可显著降低T2弛豫时间,很小浓度的SPIO即可使T2信号降低。本研究各浓度铁标记细胞T2值均较对照组低。相关研究[10]常采用MRI扫描序列中信号强度变化检测不同铁浓度SPIO。T2值可对物质信号强度量化表达。李春燕等[11]应用MRI多回波扫描并测量T2值，并计算R2值，发现含铁水模T2值与含铁水模铁浓度呈函数关系，含铁水模R2值与含铁水模铁浓度呈直线相关，认为R2值能够对体外不同铁浓度进行定量评估。本研究中，随着铁浓度升高，细胞内铁颗粒逐级增加，磁标记hUCMSCs R2值同标记铁浓度呈直线相关，符合这一规律。

Baghchechi等[12]将30 μg/mL铁的Feridex直接与人神经干细胞孵育24 h，细胞磁标记率达到85%。吴莉等[8]将25、50、75、100 μg/mL铁的SPIO(Sigma公司)-PLL混合液，张瑞平等[13]将25、50、100和150 μg/mL铁SPIO(德国Schering公司)-PLL混合液，分别用于标记BMSCs,发现各组细胞标记率可达到100%，但100 μg/mL铁标记浓度均影响细胞活性。Mishra等[14]研究显示，50 μg/mL铁的氧化铁-PLL混合液为最适标记铁浓度。本课题组合成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs较商用SPIO-PLL混合液具有更好的生物相容性，更高的安全标记浓度下，细胞内铁含量更高。在64 μg/mL铁标记浓度条件下，标记率达到99.56%，纳米铁标记细胞T2值较低浓度标记细胞明显降低，说明细胞内铁含量较低浓度标记细胞明显增多，而干细胞迁移能力仍未受明显影响，因此该纳米铁颗粒是较为理想的hUCMSCs标记材料。

可见，本研究制备的γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs易于被hUCMSCs摄取，铁浓度为64 μg/mL即可达到有效标记，对细胞活力及迁移能力无明显影响，又可被MR T2WI序列检测。