胃癌组织中细丝蛋白A表达变化及其对患者预后的影响

崔国才，史建伟，彭鑫宇，郭剑，刘小锐，李杰

(1 河北大学医学院，河北保定 071000；2 河北大学附属医院)

胃癌是消化道的常见恶性肿瘤之一，我国每年新增胃癌患者约50万，占全球的50%左右，并且发病率和病死率呈上升趋势[1]。复发和转移是胃癌患者死亡的重要原因。细丝蛋白A(FLNa)是非肌性肌动蛋白结合蛋白家族成员之一，其通过调控细胞骨架结构的动态改变而调节机体细胞的分裂、增殖、迁移和侵袭等诸多生物行为，同时还是细胞内信号转导的支架蛋白，与肿瘤的形成发展密切相关[2～5]。但FLNa与胃癌发生发展的关系尚未见系统报道。本研究采用免疫组织化学法检测FLNa蛋白在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达情况，并分析其表达与患者临床特征、生存期及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取河北大学附属医院2006年1月～2007年1月收治的51例胃癌患者,其中男29例、女22例，≥60岁25例、<60岁26例。所有入组病例经病理学确诊，无其他器官原发恶性肿瘤，术前无放疗、化疗、免疫治疗及中医药治疗史，都有完整的临床和随访资料。手术切除肿瘤组织，癌组织取自癌灶中心处，正常胃黏膜组织取自距癌灶边缘至少5 cm处。随访截止日期为2012年7月。

1.2 FLNa检测 免疫组化采用SP法。胃癌组织和正常胃黏膜组织标本使用10%中性甲醛固定，石蜡包埋。组织蜡块切成4 μm厚薄片，经脱蜡、水化后，放入枸橼酸缓冲液内，置于微波炉内(95 ℃、15 min)修复抗原。在3%过氧化氢中孵育20 min，PBS液冲洗，使用免疫组化试剂盒中的血清封闭，分别滴加兔抗人FLNa一抗(1∶150)，在4 ℃冰箱内过夜，PBS液冲洗，滴加组化试剂盒中生物素标记的相关二抗，放置在室温30 min。PBS液冲洗，滴加用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，放置于室温30 min，PBS液冲洗，DAB液显色，自来水清洗，经苏木精染色、脱水、二甲苯透明后，树胶封片。用人子宫组织染色作为FLNa蛋白的阳性对照，PBS液代替一抗染色作为阴性对照。光学显微镜下观察FLNa蛋白的免疫组化结果，在高倍镜下选择5个视野计数，每个高倍视野下计数200个细胞，计算出平均细胞阳性率。染色强度分为浅染、淡黄和棕黄3个等级，颗粒状态又分为无明显颗粒、稀疏颗粒和弥漫性颗粒3种情况。综合分析每张切片的阳性率及染色强度，将免疫组织化学染色结果分为3级：阳性细胞数<25%，染色较淡，未见明显颗粒者定为阴性；阳性细胞数25%～<50%，染色淡，可见稀疏颗粒者定为弱阳性；阳性细胞数≥50%，染色棕黄，可见弥漫性颗粒者定为强阳性。将弱阳性和强阳性均定义为阳性。由2名高资历的病理医师阅片，共同确定判定结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法检验，多因素分析采用Cox回归模型，生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和正常胃黏膜中FLNa表达比较 FLNa阳性表达定位于细胞质。胃癌组织和正常胃黏膜中FLNa阳性表达率分别为47.1%(24/51)、90.2%(46/51)，两者比较χ2=34.622,P=0.000。

2.2 胃癌组织中FLNa表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

2.3 胃癌组织中FLNa表达与患者生存预后的关系 将患者年龄、性别、淋巴结转移(有或无淋巴结转移)、肿瘤浸润深度(侵及或未侵及浆膜)和FLNa表达(阳性与阴性)等因素进行Cox回归分析，结果表明肿瘤浸润深度、淋巴结转移和FLNa表达是影响胃癌患者术后预后的独立因素，见表2。FLNa阳性、阴性表达者生存期分别为(60.9±2.1)、(23.8±2.2)月，两组比较P=0.000。

表1 胃癌组织中FLNa表达与患者临床病理特征的关系

表2 胃癌患者预后相关影响因素的多因素分析

3 讨论

FLNa属非肌性肌动蛋白结合蛋白，是细丝蛋白家族成员，该基因表达广泛，结构保守，影响哺乳动物的生长发育。FLNa蛋白二聚体的亚基含有一个氨基端的肌动蛋白结合结构域和一个棒状结构域，间隔两个分别由大约30个氨基酸残基形成的链状结构，两条多肽链在羧基端在第24个重复序列尾端相连接，构成“V”形同源二聚体而发挥功能[6]。FLNa蛋白主要分布于细胞质内，蛋白结构中的棒状结构中含有多重β-片层，是多种具有重要功能的蛋白质发生相互作用的界面，其中的多数蛋白质是细胞内信号分子的膜受体，同时还兼有信号转导支架蛋白的功能，在细胞增殖、黏附、迁徙等多种行为中发挥重要作用[7]。

目前的研究证实，FLNa与恶性肿瘤发生发展具有相关性。史建伟等[8,9]将含有FLNa cDNA的质粒，通过脂质体转染人结肠癌SW480细胞株，使其FLNa基因过表达，结果表明，FLNa抑制了SW480细胞株的体内外侵袭能力。Jin等[10]发现，宫颈癌组织中FLNa表达与患者的淋巴结转移、宫旁浸润和新辅助化疗疗效及预后有关。Xu等[11]发现，FLNa能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。Sun等[12]发现，FLNa抑制人胃癌SGC-7901细胞株的体外侵袭和转移能力。Tian等[13]发现，FLNa在结直肠癌中呈低表达，与结直肠癌的发生发展密切相关，是判断结直肠癌患者预后的重要指标。本研究应用免疫组化法检测FLNa在胃癌组织和胃正常黏膜组织中的表达情况，结果证实癌组织中FLNa阳性表达率低于正常黏膜组织。进一步分析表明，FLNa的表达与患者是否存在肝转移、淋巴结转移以及肿瘤浸润深度有关。并且多因素分析提示，FLNa表达是影响胃癌患者术后生存的独立因素，生存分析发现FLNa阳性表达者术后生存期长于阴性表达者。

目前对FLNa抑癌的机制尚在研究中。Zhu等[14]发现，FLNa以Ras-GRF1为中介调节细胞信号传导的Ras/ERK通路、抑制基质金属蛋白酶9的表达，阻遏其对细胞外基质的降解、降低肿瘤细胞的侵袭能力。Fiori等[15]发现，受表皮生长因子刺激的人黑色素瘤M2细胞(缺失FLNa)中表皮生长因子受体酪氨酸的泛素化水平较M2A7细胞(表达FLNa)低，深入研究后发现，FLNa蛋白合成量减少影响表皮生长因子受体和泛素连接酶c-Cb1链间的相互作用，导致抗表皮生长因子诱导的表皮生长因子受体降解受到显著的遏制，相反在表达FLNa的细胞中表皮生长因子受体的降解加速，据此推测FLNa通过抑制表皮生长因子受体的活性，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。Zhou等[16]发现，FLNa通过HGF/c-MET信号传导通路调节肿瘤细胞的迁移能力。Sun等[17]发现，FLNa通过降低MMP-9的表达而抑制前列腺癌细胞的侵袭力。此外，Feng等[18]通过使用酵母双杂交实验，并结合肿瘤细胞信号转导通路的研究方法证实，FLNa能够特异性地与G蛋白耦联受体、GTP结合蛋白结合，参与调节肿瘤的形成发展。

综上所述，FLNa在胃癌组织中表达降低，与胃癌的形成和发展密切相关，并且可作为预后判断的重要指标。