移植肝缺血/再灌注损伤的保护措施

蓝海斌，许蜂蜂，程远，桑勇勇，王华翔，孔雨薇，杨芳，蔡秋程，刘建勇，江艺（.蚌埠医学院教学医院联勤保障部队第九〇〇医院肝胆外科，福建 福州5005；.厦门大学附属东方医院肝胆外科，福建 福州 5005 ；.福建医科大学教学医院联勤保障部队第九〇〇医院肝胆外科，福建 福州 5005；.联勤保障部队第九〇〇医院肝胆外科，福建 福州 5005）

肝缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）是指因肝脏失去血液供应，导致器官缺氧引起的一种病理生理过程，通常分为热缺血损伤和冷缺血损伤。热缺血损伤通常发生于供肝切除术中过长时间阻断血流供应、休克、创伤及心衰等情况下肝血流量减少引起，冷缺血损伤发生于移植供肝冷保存［1-2］。供肝缺血时间、供肝手术时间过长及术后的全身炎症反应会导致移植肝功能不全、原发性移植肝无功能、急性肾损伤、肠道损伤［3］和急性呼吸窘迫综合征［4］等的发生，极大地增加了围术期患者的发病率和病死率［5］。随着肝移植技术的成熟，等待和完成肝移植手术的人数正逐年上升，但IRI仍旧威胁着移植患者的生命。因此，为解决IRI带来的问题，在手术灌注方式上，人们进行了多样的尝试，存在先开放动脉、先开放门静脉及先开下腔静脉等多种术式。肝脏保存方式也有了巨大的变化，从传统的静态低温灌注液保存法到低温机械灌注法及亚常温、常温机械灌注法，以及研究抗氧化生物酶在IRI的应用。

1 IRI产生的机制

肝脏在机体停止供氧和葡萄糖后，细胞内线粒体功能失调，随着三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）不断被消耗，离子泵受损，细胞内外离子浓度梯度失衡，Na+、K+和Ca2+等离子的失衡造成细胞水肿和细胞内各种生物酶异常激活，诱导细胞坏死和凋亡，释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）分子，并产生活性氧（reactive oxygen species ，ROS)和激活补体系统［2，6］。肝脏恢复灌注后，肝损伤并没有随着氧供的恢复而减轻，反而损伤加重，再灌注后的6 h内，库普弗细胞发挥着重要的损伤作用［7］，产生的ROS激活库普弗细胞，而库普弗细胞又能释放出更多的ROS（ROS能直接对细胞造成损伤），使得库普弗细胞不断地自我激活和自我破坏，造成严重的细胞损伤。此外库普弗细胞还能产生多种细胞因子，例如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白细胞介素-1（interleukin，IL-1），这些细胞因子能使血管内皮细胞和肝细胞释放ROS、并表达细胞表皮黏附分子，而且能诱导血小板、中性粒细胞聚集于肝血窦中，影响微循环血流，造成细胞损伤。此外活化的补体系统也能激活库普弗细胞，并形成攻膜复合体直接破坏细胞。

再灌注后的6 ～ 48 h内，招募的中性粒细胞、CD4+淋巴细胞释放大量的ROS和蛋白酶造成进一步的机体损伤和炎症反应，大量ROS的释放能使大分子复合物氧化（例如细胞色素C和心磷脂），其中细胞色素C的释放，能促进一系列酶联反应［8］，造成全身各种器官损伤。研究发现在灌注后5 min后便可检测到氧自由基O2-的释放， ROS的释放在2 ～ 6 h达到高峰［9］。此外，有动物实验表明，抗氧化治疗对肝IRI是有效的措施，可见ROS在IRI的发生中起重要的调节作用，如何减少或者阻断ROS的释放极为关键［10］。

2 关于供肝再灌注方式的探索

1963年Starzl等［11］开创了肝移植的先例，动脉氧饱和度较门静脉高，在肝移植术中采取率先开放动脉的方式，另外一种灌注方式是先开放门静脉血流，门静脉氧饱和度虽然较低，但是门静脉入肝血流占到70%以上，故其提供的氧气量和动脉相当。2001年Sadler等［12］回顾性研究比较经肝动脉和门静脉先后开放再灌注两者之间的区别，分别比较两者26例患者术后丙氨酸转氨酶（alanine transaminase， ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）等指标，发现两者在近期或者远期肝功能指标的对比上并没有明显差异，但经肝动脉灌注的患者生存时间较短。2003年Kniepeiss等［13］首次报道原位肝移植术中采取下腔静脉逆灌注的方式可以改善早期移植肝功能，减少原发性移植肝无功能及再灌注综合征的发生率。Matevossian等［14］通过大鼠实验模拟人体肝移植全过程，发现同种异体肝移植通过下腔静脉逆行灌注的方式能降低早期肝酶水平，有利于术后肝功能的恢复。同样的国内学者吕立志等［15］通过临床正、逆灌注随机研究分析证明逆灌注有助于改善肝移植IRI的发生，减少对肝细胞的损害及改善术后早期肝功能的恢复。国外学者Kern等［16］模拟大鼠原位肝移植模型，对比经下腔静脉逆行灌注法和常规门静脉正向灌注法，得出大鼠原位肝移植逆灌注法能减轻肝移植IRI。但有关逆灌注对移植肝IRI具体的保护机制鲜有报道，还需要进一步的研究及证实。

3 关于供肝保存方式的探索

传统的静态低温保存供肝（通常是0 ～ 4℃）方式，一直沿用至今，能够在一定程度上降低ATP的消耗（大约是12倍左右），但是无法阻止这一进程的发展，仍会引起细胞凋亡或者坏死，这一时间通常是24 h以内，而且低温对细胞膜脂质、细胞骨架和线粒体具有直接的损害作用［17］。为了改善这一情况，国内外学者在供肝的保存上做出许多研究［18-24］。低温（1 ～ 18℃）机械灌注（当时的灌注液为全血）用于器官保存最早是在20世纪60年代，Belzer等［18］用于肾脏的保存，到了1967年，他们将这项技术提高到了另一个高度，增加氧供于其中，使得当时肾脏的保存能达到72 h。由于当时的技术限定，灌注机械设备过大造成运输困难以及临床使用的不便限制了该技术的发展，在当时有研究表明，采用低温机械灌注保存同静态低温保存相比没有表现出优点［19］。强有力的免疫抑制剂的问世以及器官保存液的改进，使得静态低温器官保存法一直沿用至今。肝脏资源的匮乏，迫使人们将边缘性供肝（例如年龄过大、脂肪化较严重等）纳入肝移植扩大供肝标准（extended criteria donors ，ECD）之中，这些肝脏在低温下更容易受到损伤，IRI带来的危害更大，更加容易造成移植后肝功能不全甚至移植肝无功能。为了使肝脏在保存过程中尽可能地减少损伤和提高边缘供肝的利用率及受体的存活率，Yuan等［20］将低温机械灌注（目前主要应用的灌注液为威斯康星大学保存液和组氨酸 -色氨酸 - 酮戊二酸盐液）应用于移植供肝保存之中，使用经过改良后低温机械灌注保存能降低细胞新陈代谢和缓解ATP消耗的速度，循环的液体能给细胞带来新的养分、氧气和带走低温保存下的代谢毒性产物，而且能随时检测细胞的活力。此外低温机械灌注不仅能实时通过肝脏的流量和压力侧面反映肝脏的质量，并能及时对此进行药物及基因治疗，而且机械灌注模拟血管在人体内的搏动方式和频率，能很好地维持血管的功能、预防再灌注后血管痉挛的发生以及维持微循环的通畅。这些优点对于提高边缘供肝的肝功能恢复和患者的存活率都是极有好处的。

从低温到常温，温度的剧烈变化，容易使肝脏再次受到损伤。Bruinsma等［21］采用亚常温机械灌注（一般为20 ～ 30℃），对低温保存下的肝脏进行液体复温，体外实验结果显示亚常温机械灌注有助于肝脏细胞功能的改善：氧气的摄取、胆汁的产生和组织ATP含量都有明显的提高。此外，Bea等［22］采用体外常温肝脏机械灌注（normothermic ex vivo liver perfusion ，NEVLP） （37℃）装置，更好地模拟了细胞所处内环境的状态，从而不影响肝脏的新陈代谢，极大地降低IRI给人体带来的危害，减少人体发生肝功能不全、移植肝脏无功能和其他器官的损伤等问题的发生［23］。同样在2015年，研究人员成功利用体外常温灌注肝脏技术完成10例肝移植手术，术后同传统的低温保存肝移植相比较，ALT和AST均有所下降，术后个体主要的并发症的发生率也有所下降［24］。常温机械灌注能在一定程度上减轻缺血/再灌注引起的损伤，但是由于其装置较为巨大，搬运不方便，缺乏大量的临床数据支持，目前难以广泛地应用于临床实践之中。

4 关于抗氧化生物酶减轻氧化应激损伤的探索

ROS是一类来源于O2的化学反应分子，主要代表有O2-、H2O2和 OH-［25］，ROS 在 IRI的发生发展过程中起着重要的作用，通过体内抗氧化生物酶（过氧化物歧化酶、过氧化氢酶和乙醛脱氢酶）能有效地清除ROS，可能对IRI起着保护作用［9，26-27］。

4.1 过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）：SOD和CAT能有效地清除机体产生的ROS。其中SOD分为铜/锌-SOD（copper/zinc SOD ，Cu/Zn-SOD）、锰 -SOD（manganese-SOD，Mn-SOD）和细胞外-SOD（extracellular-SOD ，EC-SOD）；其中 Cu/Zn-SOD位于细胞质和细胞核中，在细胞内其抗氧化作用，Mn-SOD只存在于线粒体中，而ROS起源于此，因此Mn-SOD是对抗氧化应激相对重要的一种酶［28］，而EC-SOD存在于细胞外发挥其抗氧化作用，促进O2-转化为 O2或 H2O2，H2O2在 CAT 的作用下转化为H2O和O2［9］，O2-不能透过细胞膜进入细胞内，只能被EC-SOD所清除。通过增加SOD或SOD类似物来提高SOD活性的方式可以有效地预防各种类型的肝损伤。研究人员检测急性和慢性肝炎时发现［27］，急性期时体内SOD有明显的上升，到了慢性期SOD水平明显被抑制，这说明SOD在急性肝炎的发病中也起到一定的作用，但是SOD的半衰期只有6 min［9］，无法持续地发挥清除ROS的作用。通过基因治疗来提高在捐献者体内SOD表达水平和持续时间从而提高SOD含量和作用时间，能有效对抗肝脏缺血/再灌注引起的损伤。传统的基因导入方式大多采用以腺病毒为载体的方式，将Cu/Zn-SOD基因以腺病毒为载体的方式导入人体之中能有效地保护肝IRI，但将ECSOD导入后，SOD水平只有轻微的升高， SOD活性并没有显著的增加，因腺病毒对人体具有直接损伤作用，不可能通过增加腺病毒量来提高SOD的水平。He等［9］将EC-SOD和（或）CAT基因与纳米粒子载体融合，解决了腺病毒载体的缺陷，导入于小鼠之中，发现SOD 活性有明显的提高，SOD的过表达使得血清中的ALT水平有了明显的下降，这一作用比单独导入EC-SOD或CAT基因都要明显，间接反映了两者之间存在协同作用，也揭示了对肝IRI起到保护作用。

4.2 乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH)：再灌注后，释放的大量ROS，导致脂质过氧化产生大量的活性醛，例如丙二醛，能够和相关的蛋白或者DNA结合，造成肝细胞的破坏，加重肝IRI［29］。ALDH是一类存在人体中能够清除活性醛的酶，其中同工酶ALDH2在清除毒性醛中起主要作用，此外还能解离氧化应激中产生的醛加合物。ALDH2的保护作用最先发现于小鼠心肌细胞IRI［30］，通过使用ALDH2的激活剂Alda-1，能使心肌梗死的面积减少60%左右。ALDH2在各种器官缺血损伤中也有保护作用，例如脑、肾、肺［29］。Zhang等［29］，将ALDH2激活剂应用于肝移植之中，发现激活的ALDH2不仅起保护肝细胞的结构，而且能有效地减少肝细胞凋亡，进一步发现ALDH2还能减少活性醛的聚集和减轻炎症反应，对移植肝起一定的保护作用。此外有研究发现，选择性激活ALDH2使线粒体复合物Ⅰ功能改变和逆电子传递，使线粒体膜电位恢复，减缓ROS的产生，从而起到保护肝脏 IRI的作用［29，31］。

5 “无缺血”器官移植时代的展望

为彻底解决供肝IRI，何晓顺等［32］创新地将常温机械灌注供肝技术同肝移植术融合，完成3例“无缺血”肝移植术，术后患者恢复情况良好，全程供肝病理未见明显肝细胞坏死及凋亡，术后1周肝酶学指标恢复正常水平，近期术后暂无胆道、血管及排斥反应等并发症的发生。但目前样本含量少，远期术后效果仍不得而知，有待进一步观察和研究。这一革命性的突破，意味着IRI并不是完全无法避免的，为未来的移植道路指明方向，为更多需要肝移植的患者带来福音。

6 小 结

改善再灌注手术方式、加强机械灌注保存供肝方法及抗氧化生物酶的应用研究，有可能进一步缓解移植肝IRI，有助于肝功能恢复。“无缺血”器官移植时代将值得我们期待。