高迁移率族蛋白2在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞生物学活性的影响

陈建安，陈思玉，刘丽文，朱威威，陈晓龙，余 炎，何玉婷，孙冉冉，任志刚，李 娟，崔光莹，余祖江

郑州大学第一附属医院感染科 郑州450052

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是我国最常见和致死率较高的恶性肿瘤之一[1]。其恶性程度高，进展快，除了早期外科手术切除外，放、化疗多不能取得满意的疗效，且预后极差[2]。因此，探索HCC发生、发展的分子机制，寻找新的预后判断标志物和治疗靶点，对提高HCC治愈率具有重要的临床意义。

高迁移率族蛋白(high mobility group box,HMGB)是真核细胞核内一类含量丰富的核蛋白，功能多样。在细胞中，作为核DNA结合蛋白，HMGB1和HMGB2高度保守[3-4]。作为细胞外成分，HMGB家族与败血症、关节炎、癌症等疾病关系密切[5]。HMGB1在各种人类癌症中过表达，包括前列腺癌、人脑胶质瘤[6]、前列腺癌[7]、结直肠癌[8]和乳腺癌[9]等。更重要的是，HMGB优先结合顺铂(Ⅱ)二酰氯(顺铂)修饰的DNA或错误掺入的核苷类似物，并因此抑制核苷酸切除修复，这可能对于癌症治疗很有价值[10]。目前对HMGB2的研究相对较少，主要集中在胃癌[11]、乳腺癌[12]等。本研究利用癌症基因组图谱(TCGA)和GEO公共数据库验证HMGB2在HCC组织中的表达及其对预后的影响，同时分析了HMGB2对HCC细胞增殖、侵袭及凋亡、周期的影响，探讨其对HCC发展预测和靶向治疗的价值。

1 材料与方法

1.1TCGA和GEO公共数据库有关HCCHMGB2表达谱数据的分析

1.1.1 数据下载及过滤 下载TCGA数据库中的HCC相关数据。根据表达谱数据，对HMGB2 mRNA表达由低到高排序，低于中位数节点的样本为低表达组，高于中位数节点的样本为高表达组。下载GEO数据库中7个数据集(GSE76297，GSE10143，GSE14520，GSE25097，GSE36376，GSE102083，GSE57957)中有关HCC HMGB2 mRNA表达谱文件。数据过滤方法参见文献[13]。

1.1.2富集分析(genesetenrichmentanalysis，GSEA) 采用 GSEA 2.2.1分别对TCGA数据库中HMGB2 mRNA低表达组和高表达组进行分析。利用 GSEA网站 MsigDB数据库获得 c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt数据集，然后按缺省加权富集统计的方法进行富集分析，随机组合次数为 1 000。

1.2细胞实验主要试剂及仪器人正常肝细胞LO2、HCC细胞株SMMC7721和Hep3B购自中国科学院细胞库。DMEM培养基购自美国Gibco公司，标准胎牛血清购自美国HyClone公司，HMGB2抗体和β-actin抗体购于武汉三鹰公司，HMGB2 siRNA(序列为5’-CUGAACAUCGCCCAAAGAU-3’)及阴性对照(NC)siRNA(序列为5’-UUCUCCGAACGU GUCACGUTT-3’)由上海吉玛制药公司设计合成，脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，CCK-8试剂购于日本同仁公司，Matrigel胶和Transwell小室购于BD公司，细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司。

1.3HMGB2siRNA转染后HCC细胞生物学活性的检测

1.3.1 细胞培养及转染 细胞复苏后，用含体积分数10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。待细胞融合度达80%～90%时，取状态好的细胞用于后续实验。分别收获对数生长期的SMMC7721和Hep3B细胞接种于6孔板，用Lipofectamine2000分别转染HMGB2 siRNA、NC siRNA并设置空白对照,48 h后进行后续实验。

1.3.2 HMGB2蛋白的检测 用RIPA裂解蛋白提取试剂(中国碧云天公司)和蛋白酶抑制剂(美国罗氏公司)收集细胞和细胞裂解物，取等量蛋白行100 g/L SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜(Millipore，USA)上，用含50 g/L脱脂乳和TBS缓冲液封闭1 h，加HMGB2抗体(按1∶1 000稀释)、内参β-actin抗体(按1∶5 000稀释)，4 ℃摇床过夜，TBST洗涤3次，经二抗孵育1 h和洗涤后，将膜暴露，用Labwork对蛋白条带进行灰度分析。以目的蛋白与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖 将转染24 h后的细胞以每孔5×104个/mL的密度接种于96孔板，培养24、72和120 h后分别进行CCK-8实验。检测波长450 nm。每组3个复孔。

1.3.4 Transwell 体外迁移实验 选用孔径为8 μm 的24孔 Borden 小室，上室加入1×105个细胞，总体积200 μL，下室加入300 μL含血清培养基，每组设置3个复孔。48 h后取出小室，甲醇固定并用结晶紫染色孵育10 min以去除上层小室侧的未迁移细胞。显微镜下随机选取5个视野进行拍摄，计算每个视野的平均细胞数。

1.3.5 细胞凋亡和细胞周期的检测 转染48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入1×binding buffer 重悬细胞并调整细胞浓度为1×106个/mL，离心弃上清，用适量1×binding buffer重悬，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料混匀后避光孵育15 min，上流式仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。转染48 h后收集细胞，PBS洗2遍，2.5 g/L胰蛋白酶消化，离心弃上清，加入冰预冷的体积分数70%的乙醇4 ℃孵育1 h。1 000 r/min离心10 min，弃上清，用PBS 2 mL重悬细胞。再加入300 μL PI，4 ℃下避光孵育30 min，上流式仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.4统计学处理使用 SPSS 17.0和GraphPad Prism 5进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并行log-rank检验；HCC组织和癌旁正常组织中,以及不同临床病理特征的HCC组织中HMGB2 mRNA表达水平的比较采用两独立样本t检验；3组细胞中HMGB2蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1TCGA及GEO数据库数据分析结果

2.1.1 HCC组织中HMGB2 mRNA的表达特点 TCGA数据集及GEO数据集分析结果(表1)显示，患者年龄中位数为59岁；HCC组织中HMGB2 mRNA表达水平较癌旁正常组织升高。TCGA数据集数据分析结果显示，HCC组织中HMGB2 mRNA表达水平与种族、甲胎蛋白表达水平、TNM分期及分化程度有关，与种族、性别、 年龄无关(表2)；针对总体生存(overall survival，OS)、无进展生存(progression-free survival，PFS)的生存分析结果显示，HMGB2 mRNA高表达组预后差于低表达组(图1，χ2分别为8.162、4.819，P分别为0.028、0.004)。OS时间指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间，PFS时间指从随机化开始到患者现肿瘤进展或死亡的时间。

表1 GEO和TCGA公共数据库中HCC及癌旁正常组织中HMGB2 mRNA表达水平的比较

表2 不同临床病理特征的HCC组织中HMGB2 mRNA表达水平的比较

*：数据有缺失

图1 HMGB2 mRNA高、低表达组OS(上)、PFS(下)生存曲线

2.1.2 GSEA分析 GSEA 结果提示HMGB2 高表达样本富集到细胞周期、DNA复制、RNA降解等基因集，见图2。

从上到下依次为细胞周期(FDR=0.06)、DNA复制(FDR=0.12)、RNA降解(FDR=0.14)、错配修复(FDR=0.20)

图2GSEA分析结果

2.2HMGB2蛋白在HCC细胞中的表达见图3和表3、4。Western bolt结果显示，SMMC7721和Hep3B细胞中HMGB2蛋白表达水平高于正常肝细胞LO2；转染HMGB2 siRNA的SMMC7721、Hep3B细胞中HMGB2蛋白表达水平低于空白对照组和NC组。

图3 HMGB2蛋白的检测

2.3 3组细胞增殖、侵袭能力的比较转染HMGB2 siRNA 之后，SMMC7721和Hep3B的增殖、侵袭能力均低于NC组和空白对照组，见图4、5和表3、4。

图4 细胞增殖曲线

图5 细胞侵袭实验结果(×100)

2.4 3组细胞细胞周期、凋亡率的比较见表3、4。HMGB2 siRNA 转染的SMMC7721和Hep3B细胞被阻滞在G0/G1期，细胞凋亡率高于NC组和空白对照组。

表3 3组SMMC7721细胞HMGB2蛋白表达水平、穿膜细胞数、细胞周期和凋亡率的比较

*:与空白对照组和NC组相比，P<0.05

表4 3组Hep3B细胞HMGB2蛋白表达水平、穿膜细胞数、细胞周期和凋亡率的比较

*:与空白对照组和NC组相比，P<0.05

3 讨论

HCC是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿，早期无明显不适，且极易发生远处转移、血管侵袭和复发，诊断和治疗难度很大[14]。大多数患者在确诊时已是晚期，失去了最佳治疗时机，因此，探索能够提示早期HCC的分子指标具有重要临床意义。

HMGB2是较为保守的HMGB家族成员，有报道[15]认为高表达的HMGB2 在胚胎发育过程中具有重要作用，但在成人主要在淋巴器官和睾丸中表达。此外，在关节表面区域的软骨细胞中HMGB2亦高表达，敲除HMGB2基因后极易发展为骨关节炎[16]。近年来，多项研究证明HMGB2 在胃癌、胶质母细胞瘤和胰腺癌等肿瘤中呈现高表达，并且在肿瘤细胞增殖、侵袭转移中发挥重要作用。Li等[11]发现沉默HMGB2后，胃癌细胞MKN45的增殖能力被抑制，PCNA和Ki-67表达减少。Wu等[17]的研究表明HMGB2促进胶质母细胞瘤的增殖、侵袭，并与预后生存相关。Cai等[18]证实沉默HMGB2后，胰腺癌细胞增殖能力下降，并且HMGB2参与维持胰腺癌细胞的糖酵解进程。

本研究利用GEO和TCGA数据集证实HMGB2 mRNA在HCC组织中高表达，并且与甲胎蛋白表达水平、TNM分期、分化程度有关，即恶性程度越高，HCC组织中HMGB2 mRNA的表达越高。更重要的是，本研究发现HCC组织中HMGB2 mRNA的表达与预后关系密切，高表达患者预后差，这与Kwon等[19]的研究结果一致。有报道[20]称细胞周期的调控与肿瘤发生发展具有密不可分的关系，细胞周期调控机制受损导致细胞恶性增殖、凋亡异常、侵袭性增加。本研究利用GSEA方法发现，HMGB2 mRNA的表达与细胞周期、DNA复制、 RNA降解等有关，推测HMGB2可能是通过参与细胞周期调控和侵袭转移影响HCC细胞的生存。我们进一步利用细胞实验证实，HMGB2蛋白在HCC细胞SMMC7721和Hep3B中高表达；利用siRNA下调SMMC7721和Hep3B细胞中HMGB2的表达后，细胞增殖能力受到抑制，侵袭能力下降，细胞凋亡率升高；G0/G1期细胞增多，S期细减少，G2/M期细胞亦减少。这些结果再次提示HMGB2 有可能成为HCC临床预后评价指标，并可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。

综上所述，HMGB2的异常表达可能与HCC细胞的增殖、侵袭、凋亡等密切相关，可作为一个潜在的HCC发展的预测指标，为HCC靶向治疗提供了一定参考价值。