大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位

罗天霞，樊红琨，李立人，闫宁宁，章 茜

郑州大学基础医学院生理学教研室 郑州 450001

Junctophilin2(JP2)位于心肌细胞偶联膜复合体，是一种膜结合蛋白，可与细胞膜和内(肌)质网膜相互作用，在心肌细胞兴奋-收缩偶联过程中起到至关重要的作用[1]。在肥厚性心肌病和心力衰竭等心脏疾病中JP2蛋白表达下调，可引起心肌细胞兴奋-收缩失偶联[2]。小电导钙激活钾通道属于钙激活钾通道家族，参与心肌细胞动作电位复极化末期的构成。而动作电位复极化末期相当于心肌细胞兴奋性的相对不应期和超常期，临床发生的心律失常多见于这一时期。因此SK2通道与心律失常发生的分子机制有关[3-4]。JP2作为参与细胞膜与肌质网膜偶联膜复合体关键蛋白，是否与SK2通道具有相互作用，所知甚少。该实验主要研究大鼠心肌细胞系H9c2中JP2蛋白与SK2通道是否存在相互作用，为后续研究JP2对SK2通道的功能调控奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1材料H9c2大鼠心肌细胞系为具有心肌功能的特异心肌样细胞系，由郑州大学药理学系韩圣娜老师惠赠。DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，蛋白A/G琼脂糖珠购自美国Sigma公司。兔多克隆抗SK2抗体购自以色列Alomone Labs公司，小鼠单克隆抗JP2抗体购自英国Abcam公司。HRP标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG购自美国BioRad公司。TRITC标记的羊抗兔和FITC标记的羊抗鼠IgG购自北京中衫金桥生物技术有限公司。蛋白浓度测定试剂盒和蛋白Marker均购自美国Thermo公司。

1.2H9c2细胞培养H9c2细胞培养在含体积分数90%DMEM高糖培养基、体积分数10%胎牛血清和100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的完全培养基中，放置于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中。

1.3H9c2细胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫印迹检测将H9c2细胞中加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min离心，获得上清。同时取大鼠心肌组织裂解液作为阳性对照。95 ℃水浴5 min变性， 100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，分别用兔多克隆抗SK2抗体(1∶300)和小鼠单克隆抗JP2抗体(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗山羊抗兔及山羊抗鼠IgG(1∶14 000)室温孵育1 h，ECL化学发光法显色。

1.4H9c2细胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫共沉淀检测用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取H9c2细胞蛋白，将细胞蛋白样品分为免疫共沉淀组、无关对照组及裂解液组3组。在免疫共沉淀组加入兔多克隆抗SK2抗体或小鼠单克隆抗JP2抗体，无关对照组中加入相对应的同源无关抗体(兔多克隆抗IgG或小鼠单克隆抗IgG抗体)，4 ℃孵育过夜，加入蛋白A/G琼脂糖珠4 ℃孵育过夜。RIPA裂解液清洗沉淀复合物以去除非特异性结合的蛋白质，将琼脂糖珠-抗原抗体复合物用2×Loading Buffer重悬后，95 ℃水浴5 min使蛋白变性，100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，进行Western blot检测。

1.5H9c2细胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫荧光标记检测将H9c2细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数为0.1%TritonX-100处理，30 g/L BSA封闭，分别用兔多克隆抗SK2抗体和小鼠单克隆抗JP2抗体4 ℃孵育过夜，再分别用羊抗兔TRITC和羊抗鼠FITC标记的二抗处理，激光共聚焦显微镜在543 nm波长处激发TRITC-羊抗兔标记的样本，488 nm波长处激发FITC-羊抗鼠标记的样本，350 nm波长处激发DAPI标记的细胞核，Merge为三者融合后的图像。

2 结果

2.1H9c2细胞中SK2通道及JP2蛋白的表达以正常大鼠心肌组织裂解液作为阳性对照，结果显示H9c2细胞蛋白样品和心肌组织裂解液在60 000处均有免疫阳性条带(图1A)；H9c2细胞蛋白样品和心肌组织裂解液在97 000处均有阳性条带(图1B)；与已报道[5-6]的SK2通道及JP2蛋白相对分子质量相符。

A：SK2通道表达；B：JP2蛋白表达；1：H9c2细胞；2：大鼠心肌组织裂解液

图1H9c2细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达

2.2H9c2细胞中SK2通道与JP2蛋白免疫共沉淀检测结果见图2。

A：H9c2细胞用抗JP2抗体进行免疫共沉淀；B：H9c2细胞用抗SK2抗体进行免疫共沉淀

图2H9c2细胞中SK2与JP2的免疫共沉淀

将H9c2细胞裂解液加入抗JP2抗体孵育，无关对照组加入小鼠源无关IgG，经蛋白A/G琼脂糖珠孵育，抗SK2抗体检测，免疫共沉淀组和裂解液组在60 000处可见阳性条带，而无关对照组未见明显条带，说明H9c2细胞表达的JP2能被SK2结合。反之，采用抗SK2抗体进行免疫共沉淀，无关对照组加入兔源无关IgG，抗JP2抗体检测免疫沉淀物，免疫共沉淀组和裂解液组在97 000处可见阳性条带，而无关对照组未见明显条带。上述结果说明H9c2细胞中SK2通道与JP2存在一定的相互作用。

2.3SK2通道与JP2蛋白在H9c2细胞的定位将培养的H9c2细胞进行免疫荧光标记，并分别采用抗SK2通道(红色)和抗JP2抗体(绿色)孵育，激光共聚焦显微镜扫描观察。Merge图像橙色提示它们之间的共分布，可见SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞胞质中存在部分共定位。见图3。

图3 H9c2细胞SK2和JP2的免疫荧光染色(×40)

3 讨论

本研究采用分子生物学的方法，初步证实在大鼠H9c2心肌细胞中存在SK2通道及JP2的表达，进一步通过免疫共沉淀及免疫荧光标记方法观察到SK2与JP2蛋白可形成免疫沉淀复合物，二者在细胞质中存在共定位，提示H9c2细胞中SK2通道与JP2具有相互作用。

SK2通道是存在于人和小鼠心肌细胞内参与动作电位复极化末期的重要离子通道。在各类房颤中发现SK2通道可参与心房的电重构。Li等[4]报道，敲除SK2通道的小鼠可出现动作电位间期延长和房颤的易感性增加；而在快速型心率失常的兔肺静脉中SK2通道细胞膜转运增加，复极化延长，促进了房颤的发生[7]。因此，理解SK2通道的分子调控对研究心律失常等心脏疾病的治疗有非常重要的意义。JP2是位于心肌耦联膜复合体中重要的心脏特异性蛋白，在肥厚型心肌病患者中证实编码JP2蛋白的基因发生突变，肌质网释放钙离子异常[8-10]。以上研究结果提示JP2蛋白表达异常与心脏疾病的发生密切相关。H9c2细胞株以大鼠胚胎心脏内的心室组织为最初的细胞培养来源，是具有心肌功能的特异心肌样细胞系，作为心脏成肌细胞常用于心肌疾病研究。He等[11]在H9c2细胞中研究了乙酰胆碱敏感的钾离子通道的功能；Fretwell等[12]以外源的细胞系H9c2研究了大电导钙激活钾通道的调控；本实验室之前采用免疫共沉淀及GST-pulldown等方法证实在小鼠心肌组织中SK2通道与JP2的MORN区存在相互作用[13]。但目前有关大鼠H9c2心肌细胞系中SK2通道与JP2的研究，仍未见报道。H9c2作为易于传代培养的心肌细胞系，心肌功能特征与体内相似，为后续对心肌离子通道SK2功能进行研究奠定了实验基础。

JP2是偶联细胞膜与肌质网膜的关键蛋白分子。Golini等[14]研究证实，JP2偶联钙离子通道有重要的生理意义，JP1和JP2可与细胞膜上的L型钙通道相互作用进而调控钙离子参与兴奋-收缩偶联过程。还有学者[15]报道，JP2与TRPC3钙离子释放通道偶联并介导肌质网通过兰尼碱受体释放钙离子过程。而SK2通道作为细胞膜上通过细胞内钙离子浓度改变而实现功能的钾离子通道，与JP2是否存在偶联，本实验初步从结构上探讨了二者之间的相互作用。已有研究[16]证明了JP2在心肌钙致钙释放过程中的重要作用，但是否因与SK2通道的相互作用而引起，尚不清楚。机体可兴奋细胞的离子通道发挥正常生理功能主要依赖于细胞膜表面通道蛋白的数量和精确的定位[17]，JP2蛋白是否会影响心肌SK2通道在细胞膜上的表达、定位及SK2通道功能，这些问题均需进一步的研究。

综上所述，对于SK2通道和JP2蛋白的研究将有助于了解心肌疾病的发病机制，为房颤等心肌疾病防治提供新的理论依据和治疗靶点。