新疆地区MTHFR基因C677T多态性与男性严重少精子症的相关性分析

左亚军 艾热提·阿皮孜 邵为民 张金可 陈涤平

新疆医科大学第一附属医院泌尿外科中心（乌鲁木齐 830000）

近些年有关研究表明育龄中约有15%男女受到不孕不育的困扰，其中男女患病比例基本相等，大约各占一半[1]。虽然目前各种诊断手段不断出现，但仍有约40%～50%的男性不育原因不明[2]。精液质量决定着男性的生育能力，近年来基因与精液质量的关系是临床学者研究的热点。现研究表明，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）在机体内不可逆的催化叶酸发生生化反应，其可直接影响机体对叶酸的利用及代谢，叶酸的代谢对于细胞的正常功能是至关重要的，其参与了甲硫氨酸的生产过程及嘌呤和嘧啶的合成。因此合成该酶的相关基因的改变可能会影响精子的发生。同时也有一些研究提示MTHFR基因多态性可能有民族或地理上的差异，而这种多态性对男性生育能力的影响也可能受到某些其他因素的制约，比如环境因素、饮食习惯以及营养状况等[3,4]。本次研究主要分析新疆地区MTHFR基因C677T多态性与严重少精子症不育男性患者是否存在关联，探讨该基因多态性对严重少精子症患者的影响。

资料与方法

一、研究对象

1. 病例组：选取2017年上半年就诊于新疆医科大学第一附属医院生殖助孕与泌尿男科的中重度少精子症患者154人，汉族，年龄22～45岁；对照组：以同一时间段就诊于我院经精液分析且精液质量正常的294例男性。

2. 纳入标准为：禁欲2～7d，手淫取精，精液常规分析确定为中重度少精子症（5×106/mL＜精子密度＜10×106/mL为中度少精子症；精子密度＜5×106/mL为重度少精子症）。

3. 排除标准：（1）染色异常（包括核型、Y染色体微缺失）；（2）存在精索静脉曲张；（3）有隐睾的病史；（4）生殖系统严重感染或手术史；（5）病毒性腮腺炎的病史；（6）长期吸烟史；（7）明显的环境污染物暴露（重金属接触、放射化学物质等接触）史。

二、基因分析方法

1. 标本采集：对所有研究对象抽取静脉血，装于特定的抗凝管（含有乙二胺四乙酸二钠（EwDTA-2NA）中， 并全血保存于特定温度的冰箱里。

2. 血液基因组DNA提取：购买上海百敖科技股份有限公司生产的血液基因组DNA抽提试剂盒提取全血基因组DNA。

3. 纯度和浓度检测：使用琼脂糖凝胶电泳的方法估计所提取DNA的浓度和纯度。

4. 购买相关试剂盒：采用PCR（购自美国应用生物系统公司）一荧光探针法定性检测MTHFR C677T多态性位点基因型。

三、统计学方法

使用SPSS 22.0软件，将计算的两组等位基因和基因型频率进行比较并采用x2检验进行统计学分析。检验水准（α）为0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

MTHFR C677T在病例组与对照组基因型及等位基因频率比较[n(%)]，见表1。

表1 MTHFR C677T在病例组与对照组基因型及等位基因频率比较[n(%)]

表1中显示：病例组和对照组TT基因型构成比及等位基因分布及频率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。对照组中CC型基因频率（32.3%）明显高于病例组（21.4%），对照组TT型基因频率（20.8%）明显小于病例组（42.3%)，差异均具有统计学意义（P＜0.05；OR=2.926，95%CI=1.721～4.975）；两组等位基因C、T进行比较[视CC型基因（野生型）为2个C等位基因，CT型基因（杂交型）为1个C等位基因和1个T等位基因，TT型基因（纯合突变型）为2个T等位基因]，差异也均具有统计学意义（P＜0.05；OR=1.847，95%CI=1.396-2.443）。在基因型为CT的病例组与对照组比较（P＞0.05，OR=1.231，95%CI=0.747～2.029），差异不具有统计学意义。OR是暴露因素与疾病发生之间的联系强度，其数值越大，提示该基因与严重少精子症发生之间的相关性越强。本研究分析结果提示：MTHFR基因多态性的TT型基因及T等位基因可能是严重少精子症的危险因素。

讨 论

人类MTHFR基因首先由Montjean等[5]成功克隆，并且被定位于第1号染色体短臂（1p36.3)，cDNA长2.2 kb，该基因包含着约有21个基因编码序列，包括外显子11个和内含子10个，全长为7105 bp的tuRNA，其氨基酸序列高度保守。在目前发现的MTHFR基因10余种基因突变的类型中，基因C677T的点突变最为常见，即突变基因外显子中的第677个核苷酸由C突变为T，该基因编码改变致使体内该基因密码子编辑的的丙氨酸变为缬氨酸，该突变可产生3种基因类型：野生型（即CC基因型）、杂交型（即CT基因型）和纯合突变型（即TT基因型），也有一些相关研究表明，该基因的突变致使MTHFR的活性存在不同程度的降低[6,7]，使叶酸在甲硫氨酸代谢循环中的作用丧失或降低。

MTHFR在体内叶酸代谢中的生化作用主要是影响DNA合成与甲基化。在全球人类基因组677 T的甲基化低于677 C基因[8]，而DNA低甲基化从而引起相关基因的表达，而且会诱导尿嘧啶在DNA合成发生错误，最终导致DNA的修复出现错误、DNA链的断裂及出现染色体异常。在叶酸利用的过程中也维持体内同型半胱氨酸的动态平衡，从而避免同型半胱氨酸在体内堆积，而引起高同型半胱氨酸血症（hyperhornocysteinemia，Hhcy）[9]。Zetterberg等[10]研究同样表明，MTHFRC677T的多态性的纯合子（TT基因型）与杂合子（CT基因型）分别和野生型相比，更可能存在高同型半胱氨酸血症。在细胞生理学上的MTHFR突变是自动氧化的，导致有毒活性氧代谢物的产生，人类精子极易受到氧化损伤及抗氧化剂的影响，叶酸的充分利用可克服氧化应激对精子的损害，以保持DNA的完整性。因此，除了甲基化作用外，同型半胱氨酸介导的DNA氧化损伤可能是男性不育的另一种机制。同时有些研究表明，MTHFR基因多态性有可能通过基因多态性影响酶的活性[11]引起高同型半胱氨酸血症而导致睾丸生精功能受损导致男性不育[12]。

目前有很多项目对MTHFR基因都有着很深刻的研究，在动物实验中，Zhou等研究[13]显示该基因在睾丸的表达明显高于肝脏等其他器官，提示该基因的表达可能与精子的发生有密切的关系，同时也有一些对MTHFR基因敲除后的实验[14]，基因敲除后的小鼠出现了精子生成严重受到影响，并丧失了生育的能力，证实了MTHFR基因参与了雄性生殖过程，并在其中起到重要作用。有些关于MTHFR基因的多态性的研究表明，该基因的多态性可能通过影响精原细胞DNA复制过程的甲基化而影响精子的发生。如Song等[15]通过外界给予生物制剂脱氧胞苷类似物抑制小鼠的DNA甲基化，发现小鼠睾丸产生的精子活力及受孕能力有着显著的下降。Chan 等[16]运用小鼠建立的动物模型发现，MTHFR敲除的白色变种实验室雄性小鼠出现了睾丸功能障碍的症状及无法生育，检测发现其精子中印迹基因的甲基化出现了严重的混乱。这也更加验证了精子的发生与MTHFR基因相关。

同时，一些研究还发现MTHFR基因的多态性中各基因型的分布频率在不同国家也有所不同[17,18]。在对于MTHFRC677T多态性与男性不育相关性的研究中，亚洲人群与欧洲人群的报道结果不尽相同，亚洲部分国家[19]和我国部分地区[20]相关研究中提示存在相关性，而欧洲部分国家的相关性研究[21]显示差异无统计学意义，无相关性，其中原因还需要进一步的探讨。

本研究结果提示：男性严重少精子症患者与对照组TT基因型和等位基因分布及频率比较，差异具统计学意义（P＜0.05）。MTHFR的TT基因型及T等位基因可能是严重少精子症的危险因素。这与国内的一些研究[22,23]结果一致。本研究对于MTHFR基因的多态性与男性不育的相关性做了初步的研究，其作用的机制还需要更进一步的探讨，此次研究为疾病诊断提供了初步思路和线索，对疾病治疗方案的制定有一定的帮助。但本次的研究所收集的病例较少，且未进行分层分析，故具有一定局限性，此后还需进一步深入探讨。