诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化研究进展

宋忠阳，张志明，雍文兴，王功臣，陈玉婵

（甘肃中医药大学1 研究生院，2 附属医院急诊科，3 附属医院肿瘤科，兰州 730000；4 甘肃中医药大学定西校区医学教学部，定西 743000）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）属于成体干细胞（adult stem cells，ASCs），是中胚层中的早期细胞，在体外培养时，经过不同的诱导条件，可以向不同的普系分化，可多向分化为心肌细胞、神经元细胞、成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等[1,2]。BMSCs 具有多向分化潜能，可以自体移植，合乎伦理道德要求，具有低免疫源性，易于分离，体外培养具有高度的扩增能力，且多次传代后保持良好的基因稳定性，因此，在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景[3,4]。近年大量实验研究[5,6]表明，通过细胞移植技术将BMSCs 植入受损心肌组织中，可以对损伤的心肌组织有一定的修复作用，通过诱导剂诱导BMSCs 向心肌样细胞定向分化，对治疗心肌损伤更具有靶向性。临床研究[7,8]表明，自体移植 BMSCs 可以促进新生血管的生成，有效改善急性心肌梗死患者心肌组织的缺血状态，促进患者心功能的恢复，对急性心肌梗死及心肌缺血具有显著的治疗效果。然而，诱导BMSCs 向心肌细胞分化的诱导方法研究及临床移植研究状况近年还缺乏整理和系统总结，本文主要对此进行综述，为BMSCs在心肌损伤性疾病治疗中的应用提供参考。

1 外界条件诱导BMSCs 向心肌细胞分化

BMSCs 具有多向分化性，其分化受到外界环境的影响，如何确保BMSCs 向心肌细胞高效率的分化是治疗心脏相关疾病的关键。研究发现通过相应的物质诱导，如体外化学物质、中药含药血清、细胞因子、模拟心肌样微环境等诱导的方式，可促使BMSCs 不同程度的向心肌细胞分化。

1.1 化学、生物诱导剂

1.1.1 5-氮胞苷

化学药物5-氮杂胞苷（5-aza）是一种经典的促进BMSCs 向心肌细胞分化的诱导剂，也是公认的能够诱导BMSCs 向心肌细胞分化的诱导剂，但5-aza对细胞毒性较大，故最新单独使用5-aza 的研究报道逐渐减少[9]。胡佳[10]研究5-aza 诱导骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死，5-aza 诱导组凋亡心肌细胞数量，caspase、Bax、Bad、Bak 蛋白表达明显低于BMSCs 组，而Bcl-2、Bcl-xl 蛋白含量表达明显高于BMSCs 组，说明通过5-aza 能提高BMSCs 向心肌细胞的分化率，提高心肌细胞抗凋亡能力。

1.1.2 环磷腺苷葡胺

环磷腺苷葡胺（MCA）是环磷腺苷的一种衍生物，属于非洋地黄类强心药物，研究发现，其可诱导BMSCs 分化为心肌细胞，MCA 由环磷腺苷与葡甲胺结合而成，具有较强的脂溶性，细胞毒性较低，容易透过脂溶性细胞膜进入心肌内发挥作用[11]。李丹[12]利用MCA 诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，在第3 代BMSCs 加入MCA 同时与5-aza 对比，结果MCA 组缝隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达量最高，表明MCA 能够诱导BMSCs 向心肌细胞分化，且诱导浓度为10-3mol/L效果最佳。

1.1.3 血管紧张素-Ⅱ

血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）不但是一种能够调节水钠代谢及血管扩张力的细胞因子，同时也是促进血管平滑肌和成纤维细胞增殖的生长因子，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的重要组成部分[13]，在心血管疾病的治疗中发挥重要作用，Ang Ⅱ可诱导BMSCs 向心肌细胞分化。石静宝[14]分别用不同浓度的Ang Ⅱ诱导，当AngII 浓度为0.1μmol/L 组的细胞增殖抑制率明显低于其他各组，cTnT、β-MHC 阳性率明显高于其他组，且心肌细胞转录因子4（GATA-4、Nkx2.5 表达阳性，证明0.1μmol/L AngII 为诱导BMSCs 分化为心肌细胞的最佳浓度。

1.1.4 骨形态发生蛋白2

骨形态发生蛋白2 ( bone morphogenetic protein，BMP-2) 也是诱导BMSCs 向心肌细胞分化的诱导剂之一。BMP-2 是转化生长因子β 超家族中的一员，是心脏中重要的细胞因子，能够促进胚胎早期发育，调节多种细胞生长、分化和凋亡。

Miao 等[15]将BMSCs 与BMP-2 诱导先一起进行培养，再移植到大鼠梗死心肌中，与未诱导的BMSCs 移植进行对照，发现BMP-2 诱导后大鼠心肌纤维化和炎性细胞浸润减轻，cTnT 和心肌细胞特有Cx43 的表达呈阳性，心功能指标左室射血分数及左心室缩短分数明显升高，由此证明，BMP-2 能够诱导BMSCs 向类心肌细胞分化，治疗心肌梗死疗效优于未诱导的BMSCs。

陈晓依[16]用PFT-α 联合BMP-2 诱导BMSCs 分化，结果联合组BMSCs 细胞的心肌肌钙蛋白I（cTnI）、Cx43 及TPM 表达明显高于PFT-α 和BMP-2分别单独诱导组，即PFT-α、BMP-2 联合诱导的效果明显高于单独使用PFT-α 或BMP-2 的效果，并更加安全。

1.1.5 Wnt-11

Wnt-11 属于Wnt 家族成员之一，Wnt 家族能够参与调节细胞增殖与迁移、神经系统与心脏发育、干细胞分化及更新等多种生理过程，并在其中起着重要的作用[17]，而Wnt-11 可定向诱导BMSCs 向心肌样细胞分化。刘源[18]利用不同浓度的Wnt-11 体外诱导BMSCs向心肌细胞分化，发现200ng/ml Wnt-11时desmin、Cx43、cTnI 的表达率最高，同样GATA-4、Nkx2.5 基因在浓度200ng/ml 组表达最强，由此最终确定200ng/ml 为Wnt-11 定向诱导BMSCs 向心肌样细胞分化的最佳浓度。

1.1.6 生长因子

1.1.6.1 转化生长因子-β1

吴星欣[19]研究转化生长因子β1（TGF-β1）对第3 代BMSCs 向心肌细胞分化的影响，按低剂量5μg/L、高剂量10μg/L 加入诱导，结果示TGF-β1能够促进心肌肌钙蛋白 I（cTnI）、心肌平滑肌肌动蛋白(a-actin) 和心肌肌球蛋白重链（MHC）的表达，且浓度10μg/L 时cTnI、a-actin、MHC 的表达率更高。

1.1.6.2 肝细胞生长因子

孙玉河[20]用肝细胞生长因子（HGF）诱导BMSCs 分化为心肌细胞，与5-aza、HGF+ 5-aza 对照，发现HGF 联合5-aza 能促进心肌特异性基因GATA-4、α-actin 的表达，诱导BMSCs 分化效果优于单独使用HGF 或5-aza。

1.2 中药诱导

中药由于低毒性及其具有较好的安全性，是目前研究的主要诱导方法之一，也是目前研究的热点方向之一，尤其以研究较多的包括中药注射液、中药提取物、中药成分及中药复方等。

李荣[21]采用中药参附注射液诱导兔BMSCs 向心肌细胞分化，将兔BMSCs 与5-aza 和参附注射液高、低剂量进行共培养，并与单加5-aza 诱导、单加参附注射液诱导对照，结果显示同时加入参附注射液和5-aza 诱导的BMSCs 形态与心肌细胞更为相似，α-actin 与cTnT 的阳性强度明显高于其他组。由此说明参附注射液与5-aza 联合诱导能促进BMSCs向心肌细胞分化，提高BMSCs 转化效率，起到协同的作用。

张金生[22]研究中医活血化瘀法诱导BMSCs 向心肌细胞分化，选用活血化瘀中药复方血塞通胶囊含药血清进行干预，分别与益气活血药、益气药进行对照，结果表明活血化瘀组的细胞增殖指数、MHC、心肌肌钙蛋白抗体（CTNT）、和心肌细胞转录因子GATA-4 表达水平明显高于益气活血组、益气组，说明活血化瘀法、益气活血法、益气法均能够诱导BMSCs 向心肌细胞分化，其中活血化瘀法效果更好。

黄芪属于中药中的益气药，功效主要以补气固表、利尿托毒、敛疮生肌为主，研究发现[23]，黄芪主要活性成分黄芪甲苷（AST）能够保护缺血心肌细胞，降低缺血缺氧对心肌细胞的损伤。赵静苗[24]通过黄芪成分AST 诱导BMSCs 向心肌样细胞分化，与 5-aza 对照，发现AST 组细胞形态更接近于心肌样细胞，结蛋白（desmin）、α 横纹肌肌动蛋白（α-SCA）和cTnI mRNA 的表达水平更明显升高，但cTnI 表达水平降低，由此表明AST 能够诱导BMSCs分化为心肌细胞，但分化效率不如5-aza。

1.3 模拟心肌微环境

心肌细胞培养液中含有心肌细胞生长所需要的生长因子及有利于维持心肌细胞特性的细胞因子。研究发现[25,26]，微环境在干细胞定向分化中起着重要作用，通过心肌细胞培养液、BMSCs 与心肌细胞共培养或心肌组织裂解液模拟体内心肌内环境可诱导BMSCs 向心肌细胞分化，但具体的机制尚不明确，可能与细胞因子因素或细胞间的相互作用相关。

1.3.1 心肌细胞培养液

黄吕[27]通过H9C2 细胞培养液诱导大鼠BMSCs 向心肌细胞分化，用10% F12-DMEM 分别培养H9C2 细胞（阳性对照）和BMSCs（阴性对照），结果cTnT 的阳性细胞率明显高于对照组，cTnT、desmin、α-MHC和β—MHC mRNA的表达明显上调，由此证明H9C2 细胞培养液能够诱导大鼠BMSCs 向心肌细胞分化。

1.3.2 心肌细胞共培养

何林静[28]通过将BMSCs 与原代心肌细胞（CMS）间接共培养，模拟细胞移植到心肌组织后的体内微环境，诱导1 周后，BMSCs 形态上呈心肌样的改变，cTnI、α-actin、Nkx-2.5、GATA-4 基因表达明显增加，相同差异代谢产物中有7 种。由此说明模拟体内心肌内环境能够诱导BMSCs 向心肌细胞分化，且分化的BMSCs 具有心肌细胞的特性。

1.3.3 心肌组织裂解液

杨勇琴[29]比较正常心肌组织裂解液和梗死心肌组织裂解液的效果，在第3 代BMSCs 加入正常心肌裂解液和梗死心肌组织裂解液分模拟心肌微环境诱导，发现正常心肌裂解液组和梗死心肌心肌裂解液组cTnT、Cx43 蛋白表达量均高于空白对照组，且梗死心肌裂解液诱导组的蛋白表达量高于正常心肌组织裂解液诱导组，证明了正常心肌裂解液组和梗死心肌心肌裂解液均能诱导BMSCs向心肌细胞分化，而梗死心肌组织裂解液诱导作用更明显，诱导分化的效率更高。

1.4 物理特性的方法

除了一般化学药物、中药含药血清、细胞培养液等诱导外，也有相关学者进行物理特性的诱导方法探索和研究。张明惠[30]通过半固体凝胶介质诱导BMSCs使其向心肌细胞分化，把DMEM培养基和低熔点琼脂糖按不同配比配制成6.4%、3.2%、1.6%、0.8%、0.4%和0.2% 6 种物理密度基质，再将BMSCs培养在以上6 种不同物理密度的基质中，结果cTnT的mRNA 表达峰值在密度为1.6%的培养基中，α-MHC 的mRNA 表达峰值在3.2%的培养基，cTnT和α-MHC 蛋白水平的表达也分别在密度为1.6%和密度3.2%的培养基中出现阳性信号，证明半固体凝胶介质能够诱导BMSCs 向心肌细胞分化。

2 缺氧条件对BMSCs 向心肌细胞分化的影响

BMSCs 对坏死性心肌病具有治疗作用。当发生心肌梗死时，心肌细胞由于得不到有效的氧供给，而发生坏死，而BMSCs 在缺氧的条件下具有很好的耐受性，这成为治疗心梗的一大优势。张优[31]研究发现低氧处理12h 时，BMSCs 的p-Akt、Pim-1、Bcl-2表达明显上升，Bax、Caspase-3 表达明显下降，低氧组BMSCs 抗凋亡能力增强。低氧组BMSCs 移植1 周后，存活率明显提高；移植4 周后，大鼠心功能明显改善。由此证明低氧预处理BMSCs 通过激活Akt、上调Pim-1 表达抑制细胞凋亡，改善BMSCs对缺血性心脏病的治疗作用。从实验数据可以看出，在相对时间段里，BMSCs 具有一定的抗缺氧、抗凋亡能力，其对缺氧具有一定的耐受性。BMSCs 抗缺氧的机制可能与激活Akt、上调Pim-1 表达，从而刺激缺血心肌的血管再生、增加心肌细胞数量、抑制细胞凋亡有关。

3 基因转染对BMSCs 向心肌细胞分化的影响

3.1 心脏转录因子

张亚楠[32]研究通过GATA-4 基因转染第3 代BMSCs，并用5-Aza 诱导BMSCs，观察GATA-4、myc、cTnT 表达，结果发现外源基因GATA-4 能促进5-aza 诱导的BMSCs 向心肌分化，能够提高BMSCs向心肌分化的效率。

3.2 低氧诱导因子-1

低氧诱导因子-1（HIF-1）作为一种细胞在低氧/缺氧条件下作出适应性反应的关键转录因子，在心脏疾病的治疗方面被认为是最有前途的治疗基因之一。刘城[33]研究HIF-1α 基因Asn803位点在人BMSCs 分化成心肌细胞过程中的作用，分别将重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1αnative、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402、Ad-HIF-1α564/803转染至5-aza 诱导的BMSCs，Ad-HIF-1α564/803组cTnI、VEGF 蛋白表达水平明显高于其他基因组，Ad-HIF-1α564/402组HIF-1α 蛋白表达水平最高。加入姜黄素抑制后，发现抑制组VEGF mRNA 的表达水平较非抑制组下降，但Pro564Asn803双突变型HIF-1α 基因组依然高于Pro564单突变型HIF-1α 基因组，进一步证明了HIF-1α 基因Asn803 位点在HIF-1α 促进BMSCs 分化为心肌细胞的过程中起到关键作用。

3.3 其他

蒋昌科[34]研究Dnmt1 siRNA 慢病毒感染BMSCs，沉默Dnmt1 表达来诱导BMSCs 向心肌细胞分化，发现敲减Dnmt1 后CpG 甲基化水平下调，Gata-4 mRNA 的转录水平，心肌相关基因MHC、cTnT 的表达及肌早期发育调控基因Nkx2.5 mRNA、Gata-4 mRNA 的水平均上调，说明通过敲减Dnmt1 能够降低心肌发育调控基因Gata-4 启动子CpG 岛的甲基化水平，上调Gata-4 基因的表达，从而诱导BMSCs 向心肌细胞分化。

因此，由相关的实验报道分析，外源基因转染的BMSCs在体内分化后仍保持良好的遗传稳定性，且外源基因在BMSCs 中表达可以提高BMSCs 的分化率。其中血管内皮生长因子基因具有促进血管的生成，改善供血功能，外源基因转染的BMSCs，对比单纯的基因、细胞治疗，其可以有效治疗缺血性心脏病。

4 临床应用报道

增加具有完整功能的心肌细胞是治疗坏死心肌病的关键。研究表明[35]，BMSCs 可以分化为心肌细胞，其为缺血性心肌病、扩张性心肌病等引起心肌坏死的修复与重建带来希望，给我们的治疗提供了一种新的治疗策略。其细胞来源、获得方法、移植等环节及手术护理等对成功应用BMSCs 修复坏死心肌非常重要。

侯永兰[36]研究示不同类型的冠心病患者的BMSCs 的形态，增殖情况无差异；但是非冠心病的CD54、CD106 的表达低于冠心病组，某些蛋白的表达有一定的差异。

Hare[37]对照自体BMSCs 移植与异体BMSCs 移植治疗心力衰竭的临床疗效，将所有患者分为自体移植组和异体移植组，发现随着细胞治疗时间的延长，异体BMSCs 组患者毒副反应的发生率、NYHA心力衰竭分级、射血分数、6 分钟步行距离、MLHFQ 评分、主要心血管不良事件发生率等方面，异体BMSCs 组均优于自体BMSCs 组，在临床上证实了自体移植或异体移植BMSCs均能够治疗心力衰竭，但异体移植BMSCs 治疗效果更好，毒副作用更低。

自体移植的BMSCs 在治疗坏死性、扩张性心肌病等引起的心肌坏死方面，从长远角度考虑，具有很好的改善治疗作用。CD54 为细胞间黏附分子，CD106 为血管黏附分子，其与BMSCs 在外周血中的生长、迁移、黏附等特性有一定的关联。病理情况下，机体的代谢紊乱，外周血微环境可能对黏附分子的表达产生了促进作用，有待实验进一步验证。另外，BMSCs 移植治疗是近年来新的治疗手段，在治疗过程中，做好术前、术中、术后的精心准备，对患者心功能的康复十分关键，临床取得了很好的疗效，值得推广。

5 不足与展望

运用多种诱导方法诱导BMSCs 向心肌样细胞分化与其改变了BMSCs 外周血微环境有关，因此，本文作者推测，在心肌缺血的条件下，外周血中的微环境可能是影响BMSCs 向病理部位分化的主要因素，进而促使BMSCs 对坏死的组织的修复。其次，诸多研究已经证实GATA-4、HIF-1 等基因转染大鼠BMSCs 治疗心肌病的效果优于单纯的药物和细胞治疗，但尚处于实验阶段，需要进一步的临床应用和验证。目前应用自体移植的BMSCs 治疗心肌病取得了较好的临床疗效，但移植成功与否及疗效好坏与手术前后的护理工作密切相关，应得到护理研究的重视。

综上所述，BMSCs 在治疗心肌坏死方面具有较好的应用前景，运用化学药物及生物诱导分化也是目前研究报道最多的诱导方式，但仍然存在部分诱导剂诱导效率低，分化不足，毒性较大等问题，还有部分诱导方式操作复杂，对细胞会造成不同程度损伤，适用性较差。故探索更好的、能够广泛应用的BMSCs向心肌细胞定向分化的诱导方法或诱导剂，促使BMSCs 有效的增殖分化，提高BMSCs 向心肌细胞的分化率依然是BMSCs 治疗心脏疾病领域今后研究的重点。