牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

谢志勤，范 晴，谢芝勋，张民秀，谢丽基，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王 盛，罗思思，邓显文，李 孟，李 丹，刘加波

（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁， 530001）

牛 支 原 体（ Mycoplasma bovis，MB）和 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）都能引起牛呼吸系统疾病。MB属支原体科、支原体属，主要引起犊牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和关节炎等病症，以呼吸系统疾病最为常见[1]。2008年我国首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到MB，此后我国部分地区陆续报道发生了牛支原体肺炎疫情，给我国肉牛和奶牛养殖业造成了严重经济损失[2]。由于MB具有在牛体内持续存在和条件性致病等特点，长期以来由其引起的疾病一直缺乏有效的防控手段，既无有效疫苗，也无特效药物，且随着抗生素的不合理使用，耐药株出现的频率逐年增加，给该病防控增加了困难[3-4]。BVDV被认为是一种牛的“呼吸道病毒”，可在牛的下呼吸道和感染牛的肺泡巨噬细胞中分离到。所有的BVDV毒株都是免疫抑制的，从而使感染牛继发细菌性或病毒性肺炎。一些BVDV毒株（1a和1b，生物非细胞致病基因）常在牛肺中分离到，且常与呼吸道性疾病发生有关；2型病毒会导致犊牛出现严重的间质性肺炎，血小板减少，骨髓坏死和腹泻，且持续感染BVDV的犊牛或母牛一旦发病会迅速形成细菌性肺炎[5-6]。两种病原体均能引起牛呼吸道疾病，临床症状相似，难以区分，且常以混合感染形式存在，感染后都会造成严重的经济损失，因此亟需建立MB和BVDV的快速检测技术。

目前对这两种牛病原体的诊断方法主要有病毒分离、ELISA、血清中和、PCR及荧光PCR等方法[2，7-11]。其中，PCR方法因操作简便、快速、特异性强、敏感性高等优点，已被广泛应用于牛群中的病原微生物检测和诊断。多重PCR是一种高效的PCR，可在同一个PCR反应管内，同时鉴别检测多种病原体，在多种病原混合感染的鉴别诊断上具有较高的优势和临床实用价值。而二温式PCR是在常规PCR基础上发展而成的更简便的PCR检测技术。二温式PCR将退火和延伸在同一温度下完成，退化温度要比常规三温式PCR高，因此不仅提高了PCR的特异性，且二温式PCR省略了反复升温、降温导致的时间消耗，节省了时间，因而提高了疾病诊断效率[12-13]。本研究综合两种PCR方法，建立了二重二温式PCR，能同时检测MB和BVDV，从而大大缩短了反应时间。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

RNA/DNA共提试剂盒：购自北京全式金公司；PCR试剂（AMV、Taq Polymerase、MgCl2、dNTP等），pEASY-T1 载体，限制性内切酶 SpeI，体外转录试剂盒（RiboMAXTM large-scale RNA production systerm-T7 kit）：购自大连宝生物公司。

NanoDrop 2000核酸测定仪：购自美国ThermoFisher Scientific公司；Tprofessional thermocycler PCR仪：购自美国Biometra公司。

1.2 毒株

BVDV参考毒株（Oregon CV24、NADL、AV68）：购自中国兽药监察所；MB广西分离株（GL-1、BS-1、NN-1）：广西兽医研究所分离并保存。牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、蓝舌病病毒（BTV）、牛轮状病毒（BRV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）等其他牛病毒对照病原体来源见表1。

1.3 引物设计

根据GenBank数据库中发表的MB uvrC基因和BVDV的5'-UTR的保守区基因序列[14-15]，利用生物引物设计软件Primer 5.0，分别设计了两对特异性检测引物（表2），并通过NCBI核酸数据库进行同源性比对分析。引物由上海Invitrogen生物公司合成。合成的引物用灭菌超纯水稀释成25 pmol/μL，置-20 ℃备用。

1.4 核酸提取及RNA反转录

按照RNA/DNA共提试剂盒说明书，提取参试毒 株BVDV、IBRV、FMDV、VSV、BTV、BRV、PPRV的总RNA，同时提取MB的总DNA，提取的总RNA用于反转录成cDNA。反转录反应体系为10 μL：5×RT buffer 2 µL，50 µmol/L Random 9 mer 0.5 µL，5 U AMV反转录酶 0.5 µL，RNA 抑制剂 0.5 µL，10 µmol/L dNTPs 0.5 µL，RNA模板 2 µL，DePC水 4 µL。混匀瞬时离心，然后置PCR仪进行反转录，程序为 42 ℃ 60 mim，85 ℃ 5 mim，12 ℃ 5 mim。转录完成后，将反转录的cDNA及提取的DNA直接用于二重二温式PCR扩增或保存在-30 ℃备用。

表1 毒株和菌株来源

表2 设计引物序列信息

1.5 二重二温式PCR扩增条件优化

优化反应体系为25μL：2×PCR Mix（含Taq Polymerase、dNTPs、MgCl2等）12.5 μL，MB和BVDV的上、下游引物（25 pmol/µL）各0.5～2 μL，cDNA或DNA 1～2 μL，用超纯水补足至25 μL。每次检测时，设置阴阳性对照。反应程序为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 变性30 s，设置10个退火延伸温度，从61～70 ℃，共进行 35 个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳并拍照。在阴阳性对照均成立时，整个试验有效，可判定结果。

1.6 特异性试验

用优化的二重二温式PCR方法进行特异性检测，将抽提的MB DNA及BVDV、IBRV、FMDV、VSV、BTV、PPRV、BRV的cDNA加入到已建立的二重二温式PCR反应体系中进行扩增，验证MB和BVDV二重二温式PCR方法的特异性。

1.7 敏感性试验

将PCR扩增的MB和BVDV目的片断克隆到 pEASY-T1 载体，经鉴定提取阳性重组质粒。用限制性内切酶 SpeI，将BVDV重组质粒线性化，按体外转录试剂盒说明书（RiboMAXTM large-scale RNA production systerm-T7 kit）将线性化DNA转录为RNA，同时加入脱氧核糖核酸酶（DNase）消除多余的DNA。用分光光度计测定转录RNA及重组MB质粒DNA浓度，根据阿弗加德罗常数，将RNA浓度转换为拷贝数[16]。用灭菌超纯水将测定的拷贝数依次倍比稀释成1×108～1×100copies/µL，将相同浓度的两种体积混合，制备成标准品。每个标准品取1 µL为模板，用建立的二重二温式PCR方法检测，验证其敏感性。

1.8 干扰性试验

将测定的不同浓度的MB和BVDV模板混合，人工制备不同混合样品。样品组合如下：样品A：MB（105copies/µL）+ BVDV（107copies/µL）；样品B：MB（107copies/µL）+ BVDV （105copies/µL）；样品C：MB（108copies/µL）+ BVDV（104copies/µL）；样 品D：MB（104copies/µL）+ BVDV（108copies/µL）； 样 品E：MB（104copies/µL）+ BVDV（105copies/µL）。用建立的二重二温式PCR进行检测，确定不同模板浓度相差较大时，各模板间是否存在干扰现象。

1.9 临床应用试验

利用本研究建立的二重二温式PCR方法，对保存在-70 ℃的38份牛鼻黏液棉拭子和12份牛阴道棉拭子进行检测。这些样品采自广西某牛场（该牛场 2016年曾发生过牛支原体病），采集时牛没有表现临床症状。检测时以MB广西分离株和BVDV Oregon CV24株为标准对照，验证本方法对临床样品检测的准确性。

2 结果

2.1 反应体系和反应条件

对二重二温式PCR反应条件优化的最佳退火延伸温度为67 ℃，最佳浓度组合为：25 pmol/µL的MB上、下游引物各2 µL，25 pmol/µL的BVDV上、下游引物各2 µL。最佳反应体系为：2×PCR Mix（含Taq Polymerase、dNTPs、MgCl2等）12.5 µL，cDNA或DNA 1 µL，超纯水补足25 μL。最佳反应条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 变性30 s，67 ℃延伸30 s，共进行 35 个循环，12 ℃结束反应。

2.2 特异性试验

所建立的二重二温式PCR扩增出两条目的片断（MB 412 bp，BVDV 170 bp），与设计相符合。用该方法检测参试的口蹄疫、水泡性口炎、蓝舌病、牛传染性鼻气管炎、牛轮状病毒、小反刍兽疫等病原，无扩增条带，为阴性，表明该方法特异性好（表1和图1）。

图1 二重二温式PCR方法特异性

2.3 敏感性试验

将已经制备好的不同稀释倍数（1×108～1×100copies/µL）的RNA/DNA标准品（含等浓度的3种体外转录RNA/DNA）各1 µL为模板，用优化好的二重二温式PCR方法检测。结果显示，建立的二重二温式PCR检测方法最低能检测到MB、BVDV各104拷贝的病原DNA/RNA（图2），表明该检测方法灵敏度较高。

2.4 干扰性试验

将不同浓度的MB 和 BVDV体外转录RNA/DNA模板混合进行干扰试验，发现当一个模板浓度较高，而另一个较低时，所建立的方法依然可以同时检测到两种模板，不影响扩增效率，相互不受干扰（图3）。

图3 二重二温式PCR检测方法干扰性试验结果

2.5 临床样品检测

用建立的方法对38份牛鼻粘液棉拭子和12份牛阴道棉拭子进行检测，结果17份为MB阳性，3份为BVDV阳性，无两种病毒的混合感染。将PCR阳性样品，送大连宝生物公司进行序列测定，经序列比对均为对应的病毒序列，扩增结果正确，无假阳性扩增。

3 讨论

近几年我国养牛业规模不断扩大，从而使疫病防治工作面临着前所未有的压力，迫切需要简便、快速的检测技术，以保障养牛业健康发展。牛MB和BVDV感染的临床症状相似，难以区分。本研究在多重PCR和二温式PCR基础上，建立了MB和BVDV二重二温式PCR检测方法。通过将退火和延伸温度设为同一温度，设定的温度比退火温度高，比延伸温度低，这样在扩增时不仅提高了二温式PCR的特异性，而且缩短了扩增时间。

本试验根据MB和BVDV保守基因序列，设计合成两对分别扩增MB和BVDV的特异性引物，经特异性试验，发现所建立的二重二温式PCR只扩增出MB（412 bp）和BVDV（170 bp）两条目的片段，而对参试的其他毒株无扩增条带出现，说明所建立的方法具有很好的特异性。敏感性试验发现，所建立的二重二温式PCR，最低均可检测到104拷贝的MB和BVDV病原DNA/RNA。干扰性试验表明，所建立的方法对不同模板浓度都能分别扩增，干扰性小，可以满足MB和BVDV感染的临床鉴别要求。

本研究使用RNA/DNA共提试剂盒进行待检病料核酸提取，将提取的核酸用于反转录cDNA，反转录不影响提取的DNA，然后直接进行二重二温式PCR扩增。全程只需一次抽提，一次反转录，一次PCR，一次电泳即可检测两种病原，非常适合混合感染样品的检测，省时省力。

4 结论

本研究通过分析比对MB的uvrC基因和BVDV的5'端非编码区（5'-UTR）保守基因序列，并根据各自序列特征分别设计了两对特异性引物，将三温式PCR扩增程序简化为二个温度扩增，建立了二重二温式MB和BVDV PCR检测方法。经特异性试验、敏感性试验、干扰性试验和临床样品检测试验，证明该方法特异、敏感、无干扰，临床检测结果准确，表明本研究建立的方法可以用于MB和BVDV的鉴别检测和流行病学调查。