鲈鱼病毒性神经坏死病的诊断与防治

陈 晖，方成俊，肖 颖，徐淑菲，郭书林，黄印尧

（1. 东山海关技术中心，福建东山 363401；2. 厦门海关技术中心，福建厦门 361012）

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）是一种适温性广、抗病力强、生长迅速、肉质鲜美的肉质性鱼类，1983年从国外引进，现已在我国广东、福建、浙江等地大量养殖[1-3]。近年来，福建、广东省海域当年繁殖的网箱养殖鲈鱼苗，在每年的5－10月，当天气连续晴好、闷热、海面风小时，会出现吃食减少、燥动、打转等症状，1～2 d后死亡。死亡常呈成倍叠加发展，并持续扩散蔓延至整个海区，死亡率高达80%～90%，损失非常惨重。养殖1年以上的大鲈鱼也会发病，但死亡率很低。养殖户不明病因，只能采取少投料的半饥饿饲养法，因而使鲈鱼苗成活率很低，仅为10%～20%。即使存活下来的鲈鱼，也需要半年时间，食量才恢复正常，因而大大增加了养殖成本，成为当前海区鲈鱼养殖急待破解的难题[4]。

1 发病情况

福建省漳浦县某海水养殖场海水流动较好，现有网箱约20个，主要养殖当年繁殖的鲈鱼苗及已养殖1年以上的花鲈，养成后全部用活水运输船运往韩国，供应韩国料理店。近年来每到夏季，该海水养殖场饲养的当年繁殖的鲈鱼苗就会发病，死亡率极高。2017年12月，该养殖场从福建省东山县某养殖场购进3 cm长鲈鱼苗11万尾，分4个网箱饲养，饲喂专用配合饲料，每日早晚投料各1次。当时正值冬春季节，气温低，鲈鱼生长很正常，至2018年4月，鲈鱼苗成长至6～8 cm，大约存活10.5万尾。随着鱼苗长大，网箱内鲈鱼密度加大，由于工作忙，没有及时进行分箱饲养。随着气温升高，至4月底，漳浦县白天气温达32～33 ℃，天气闷热，海面上持续微风，风力小于3级。此时，网箱内的鲈鱼出现烦躁、采食量明显减少、不正常游动、平衡失调、盘旋游动、狂游、侧游、自转等症状，少量鱼苗开始死亡；到5月1日，鲈鱼病情加重，每隔1 h每个网箱都会有几百条鱼苗死亡；至5月2日送诊时，已有7万条鲈鱼死亡，死亡率为65%左右。

2 实验室检验

2.1 剖检

5月2日清晨，从网箱中捞取数十条病鱼，打包充氧运抵实验室。到实验室后，大部分鱼苗已死亡。鱼体表检查发现：鱼新鲜度好，头体、尾、鳃、鳍、肛门都完好；明显的病变是鱼眼特别明亮，微肿胀；部分病鱼一侧正常，另一侧有大小相近的一个新鲜破溃面，无化脓灶和异味。剖开腹腔发现，肝、肾、胃肠等脏器均正常，无积液和异味（图1）。

图1 病鱼体表临床症状

2.2 寄生虫检查

检查病死鱼体表皮肤、鳃、腹腔和脏器，末见寄生虫感染。

2.3 细菌学检查

（1）无菌操作，取病鱼肝脏和体表破溃处组织触片，姬姆萨氏染色镜检为阴性。

（2）无菌操作，取病鱼肝脏、体表破溃处组织和网箱内海水，分别接种于3支营养肉汤（含质量浓度1%NaCl、pH7.0）试管，30 ℃培养36 h，发现接种肝脏组织管肉汤不混浊，而鱼表破溃组织和海水管的肉汤变混浊。再将上述混浊的二管分别接种TCBS平板，进行单菌落检查，发现长出少量形态较一致的黄色菌落，通过全自动细菌分析鉴定仪鉴定，确认是溶藻弧菌。将该菌进行鲈鱼苗毒力试验，结果为阴性。

2.4 RT-PCR检测

2.4.1 材料 （1）选择数尾濒死鲈鱼脑、眼等活体组织，冻存于-80 ℃冰箱备用。（2）试验所用的磁珠法通用型RNA提取试剂盒：为赛默飞世尔科技中国有限公司产品。（3）一步法RT-PCR试剂盒：购自宝生物工程（大连）有限公司；所用序列，采用世界动物卫生组织（OIE） （水生动物疾病诊断手册》（ 第3版） 推荐的引物，引物序列为：反向引物5'-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3'，正向引物5'-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3'。（4）GeneGreen核酸染料：购自天根生化科技（北京）有限公司。

2.4.2 方法

2.4.2.1 组织样品处理 各取病鱼的脑、眼约50 mg，放在1.5 mL灭菌离心管中，用灭菌碾磨棒充分研磨捣烂，加1 mL裂解液，室温孵育3 min；加200 μL氯仿即三氯甲烷（Chloroform），小心盖上盖子，剧烈震荡15 s，室温孵育3 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清400 μL至5连管的第1个孔内。

2.4.2.2 RNA提取 采用磁珠法进行RNA提取，在5连管内分别加入相应试剂（表1），全过程在磁珠提取纯化系统中自动进行。

2.4.2.3 一步RT-PCR法 根据神经坏死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）扩增片段大小设置的RT-PCR反应液如下：PCR模板5 μL，正、反向引物各2 μL（40 μmo1），Taq酶1 μL（5 mo1/L），10×Taq酶 缓 冲 液7 μL，MgCl2（25 mmo1） 6 μL，dNTP 2 μL，M-MuLV逆转录酶（20 U/μL） 1 μL，RNA酶抑制剂（20 U/μL）0.5 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。程序设定为：首先42 ℃ 30 min、95 ℃ 5min，然后95 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，循环30次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 5连管内所加的相应试剂及剂量

2.4.3 PCR扩增结果判定 用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖（加入浓缩的10 000×GeneGreen Nucleic Acid Dye，使其在凝胶中的终浓度为1×）进行电泳，样品孔中加入6 μL样品和2 μL样品缓冲液（含0.25%溴酚蓝）的混合液，并设立DNA标准Marker对照。电泳后在紫外检测仪上观察结果发现在琼脂糖电泳的421 bp位置均出现明显的NNV特异性的亮带（图2），表明该养殖场鲈鱼苗暴发的是VNN，也称病毒性脑病和视网膜病。

图2 琼脂糖凝胶电脑图谱

3 防治

根据实验室检测结果确诊为VNN，立即采取了以下综合防治措施：

（1）24 h值班，及时捞取上浮的病死鱼，然后集中销毁；每天清理网箱，去除沉渣和粪便；在网箱内四周，吊挂清热解毒的中草药包（主要成份：板兰根、大青叶、地锦草等）[5]。

（2）在鱼饲料中加入氯苯尼考，同时用黄芪多糖拌料喂鱼（按药物使用说明书剂量），连用5 d，将原每天2次投喂改为1次，食量再减半。

上述措施的效果明显，每天死鱼数量骤减，至第5天，已没有死鱼出现，鱼群吃食、游动正常。鱼群病愈生长稳定后，在饲料中，每周3次拌入乳酸杆菌液和黄芪多糖，每天保持1次投料。

2018年10月中旬，对养殖户进行回访获知，自2018年5月采取稀疏养殖、益生菌拌料和减少饲料投放量等措施后，鱼体生长正常，从8月份开始改用新鲜冷冻巴拉鱼等杂鱼打浆，加入乳酸杆菌液和黄芪多糖拌料喂鱼（每周3次），每天上午各投料1次，鱼长势很好，体长已达15～18 cm。11月份天气转冷时，计划每天投喂2次，以提高鱼体生长速度。

4 讨论

VNN是多种海水鱼的一种急性传染病，是我国《进境动物检疫疫病名录》中的二类动物检疫对象。本病大多发生在气温较高季节，主要侵袭幼鱼的脑、视网膜和脊髓系统的神经细胞，直接造成细胞的损伤坏死，病鱼表现出烦躁、狂游、自转、侧游等一系列神经症状，鱼体表及脏器基本正常，死亡率达80%以上[6]。而本次报道的鲈鱼苗VNN，除有上述神经症状外，还有部分病死鱼侧面出现大小较为一致的新鲜破溃面，而尾鳍、胸鳍和背鳍和体色却都正常，这与由虹彩病毒引起的鱼表皮肤溃疡病（溃疡面在鱼体表呈大片溃烂，肌肉裸露坏死并有出血，尾鳍、胸鳍和背鳍基部红肿溃烂，体色变黑，鳃丝和肝脏发白）完全不同[7-9]，分析认为鲈鱼体表新鲜破溃面应该是病鱼发病时相互撕咬造成的。

当前，关于VNN的报道多集中于石斑鱼幼苗，死亡率通常在90%以上，而鲈鱼VNN报道很少。本病侵袭的对象主要是幼龄鱼苗，发病急，死亡率特别高，且防治资料很少。本次鲈鱼苗暴发的VNN，因采取措施得当，疫情很快得到有效控制。针对VNN防治，建议采取以下措施：（1）快速防治，凭临床经验，一旦确定为病毒病，立即采取针对性防制措施，控制疫情扩散；（2）针对海区网箱养殖难以隔离消毒的特点，采取每天清除积食和粪便，捞取病死鱼进行集中销毁，消灭传染源等措施；（3）网箱内吊挂清热解毒中草药，饲料中加入益生菌、黄芪多糖，以提高免疫力；（4）发病期间，饲料中加入氟苯尼考，避免继发细菌感染；（5）降低养殖密度，适当减食。实际结果证明，上述防治措施效果很好，表现在疫情很快被控制，死亡率从以往的80%以上，下降到65%左右，避免了较大的经济损失。

5 结论

2018年5月福建省漳浦县某海水养殖场养殖的鲈鱼苗出现烦躁、自转、侧游等运动失调症状，继而大批死亡，病鱼眼睛发亮、微肿，部分鱼体表有新鲜的破溃伤口，经实验室检查，寄生虫和细菌均为阴性。采集病鱼脑、眼组织，应用RT-PCR检测，扩增出NNV特异性的421 bp基因片段，说明该病为VNN。采取及时捞取病死鱼，去除网箱沉渣粪便，中草药吊袋消毒，减食和氯苯尼考、黄芪多糖、益生菌拌料等防治措施，疫情得到有效控制。该防治经验为VNN防控提供了技术参考。