郏县红牛生长发育性状全基因组关联分析

陈付英，牛 晖，施巧婷，滑留帅，冯亚杰，徐照学，王二耀*

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省肉牛工程技术研究中心有限公司，河南 郑州 450003；3.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)

郏县红牛是我国优秀的地方黄牛品种，被毛红色，体格较大，体质结实，结构匀称，后躯发育较好，肌肉丰满，耐粗饲，性格温顺，抗病力强，遗传性稳定，具有良好的肉用发展潜能。1988年至2008年的二十年间，针对郏县红牛特性特征，制定了郏县红牛品种标准，并确定由役肉兼用型向肉役兼用型发展的选育方向，促进了郏县红牛数量的发展和质量的提高。然而生长性状受诸多基因调控，单凭传统方法很难达到预期效果。

随着生物技术的发展，全基因组关联分析为复杂性状候选基因的筛选提供了更有效的方法。全基因组关联分析是在全基因组范围内筛选与目标性状相关的SNP，结果更全面。目前市场上常见的关于牛的基因组芯片，都是以国外的肉牛品种为标准设计的，只能检测到国外肉牛已知的SNP位点，难以发现我国地方黄牛的独特品质。以高通量测序为基础的SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)[1]简化测序技术，为大批量筛选中国的地方品种黄牛特性提供更多的选择。SLAF-seq简化测序技术是通过限制性内切酶消化基因组DNA，选取一定长度的片段进行测序，降低了基因组的复杂度，并且不依赖基因组序列，节约了时间和成本。该技术一经推出，就在动植物上得到了广泛应用，Wang等运用该技术研究了京海黄鸡的鸡翅重、屠宰重等性状的全基因组关联分析[2-3 ]，Han等运用该技术研究了大豆的遗传特征[4]。本研究运用SLAF-seq简化测序技术在全基因组范围内检测SNPs，并通过全基因组关联分析，寻找与郏县红牛生长性状相关的候选基因。

1 材料和方法

1.1 材料

采集平顶山郏县良种繁育场郏县红牛血样200份，每个个体数据包括初生重及不同年龄阶段(包括6月龄、12月龄、18月龄、24月龄)的体尺、体重。血样保存于-70℃超低温冰箱。血液DNA提取采用Qiagen小提DNA试剂盒，提取的DNA样品经紫外分光光度计和1%琼脂糖电泳检测，样品纯度要求OD260/230为1.7～2.2。

1.2 实验方法

候选基因筛选采用SLAF-seq全基因组简化测序技术，在全基因组范围内检测郏县红牛的SNP位点。首先以牛(Bos Taurus)基因组为参考，根据基因组大小以及GC含量等信息进行电子酶切预测。得到的酶切片段进行3＇端加A处理、连接Dual-indes测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估实验的准确性，选用拟南芥(ecotype Columbia)作为对照(control)进行测序。

SNP标记的开发是以每个SLAF标签(经过SLAF-seq建库产生的特定酶切片段，一个酶切片段就是一个SLAF 标签)中深度最高的序列类型作为参考序列，利用 bwa[5]将测序reads比对到参考序列上，并使用 GATK[6]和samtools[7]两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，基于SNP，利用TASSEL[8]软件的一般线性模型(general linear model，GLM)和混合线性模型(compressed MLM)得到关联值，公式计算如下：

Y=Xα+Qβ+Kμ+e

其中，Y为表型值向量，X为SNP基因型矩阵，Q为admixture生成的群体结构矩阵，K为SPAGeDi计算出来的亲缘关系矩阵；α为基因型效应向量，β为固定效应向量，μ为随机效应向量，e为随机误差向量。最终每个SNP位点都能得到一个关联值。通过计算1%Bonferroni校正的全基因组显著P值为3.51e-08(0.01/284799)和10%Bonferroni校正的全基因组潜在显著P值为3.51e-07(0.1/284799)。使用TASSEL3.0软件生成各时期体重全基因组关联分析的 Quantile-Quantile(QQ)图和曼哈顿图。

候选基因筛选通过NCBI和Ensembl网站获取每个SNP位点周围1M b区域内的最近的基因，将所得到的基因与COG、GO、KEGG、SwissProt、NR数据库比对，进行相关功能基因注释。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及检测

用1%的琼脂糖凝胶检测提取的牛基因组DNA(见图1)，电泳主带清晰，没有明显拖尾。利用分光光度计检测DNA浓度和纯度，OD260/280值均在1.7～2.0之间，无降解，无RNA残留，浓度均在500ng/μL之上，符合要求，可用于后续试验。

图1 牛基因组DNA检测

2.2 SLAF-seq 测序

根据牛基因组大小及GC含量等信息，选择牛基因组为参考基因组进行电子酶切预测，最终确定使用RsaI+HaeIII酶切，酶切效率为96.82%，共得到448.10Mreads。通过生物学信息分析，酶切片段长度在414-444bp的序列定义为SLAF标签，共开发339,523个SLAF标签，每个样品的平均测序深度为7.03x。根据MAF>0.05和完整度>0.8进行筛选，共得到284,799个高一致性的群体SNP。

各性状的GLM关联分析结果如图2所示，依据关联SNP连成的区域，对关联区域进行功能基因挖掘，郏县红牛生长性状的基因关联结果如表1。位于10号染色体的rs449748996与郏县红牛生长18月龄体高显著相关的SNP位点(表1)；位于23号染色体的rs210024569与6月龄体高潜在显著相关；位于29号染色体的rs42177491位点与12月龄胸围潜在显著相关。在每个显著或潜在显著相关位点周围1Mb的范围内寻找可能的候选基因，结果找到可能的4个候选基因，分别为LOC100337124、C6orf106、SNRPC和JAM3。

表1 与生长性状显著相关的SNPs

图2 生长性状关联的分析曼哈顿图QQ-plot图

注：左图为关联分析的曼哈顿图，图中纵坐标为关联值的-lg值，横坐标为染色体。一个点代表一个SNP位点；蓝色虚线位置为多重假设检验(FDR检验)的显著性阈值，高于阈值的点为关联显著位置；红色虚线为0.1/SNP总数目的负对数。右图为QQ-plot图，实线是预测的阈值，SNP与实线在前端贴合一致，仅在末端翘起，代表SNP假阳性低，关联结果可靠。

表2 候选基因GO注释

3 讨论

本研究的目的是在全基因组范围内筛选出与郏县红牛生长性状相关的候选基因。郏县红牛是我国优秀的地方黄牛品种，为提高其肉用性能，陆续引入丹麦红牛、红安格斯牛、南德温牛、夏洛莱牛等进行杂交改良。随着杂交改良的推广，郏县红牛纯种数量下降，不利于郏县红牛的进一步开发利用。郏县红牛在千百年的育种过程中保存许多优良性状，已发现的遗传缺陷基因在群体中频率极低，是未来育种不可或缺的素材。本研究利用全基因组简化测序技术，从全基因组范围内筛选与郏县红牛生长性状相关的候选，挖掘郏县红牛的遗传潜力，为郏县红牛的进一步选育和提高提供理论依据。

应用SLAF-seq简化测序技术检测郏县红牛全基因组SNP，共得到284,799个高一致性的群体SNP。将到的SNP与郏县红牛的生长性状关联分析，结果显示，位于10号染色体rs449748996位点与18月龄体高显著相关(P=9.88E-13)，说明该位点对18月龄体高有重要影响。该突变位于LOC100337124基因的第1内含子。LOC100337124基因编码的蛋白为磷酸二脂酶8B-like。磷酸二酯酶(PDEs)具有水解细胞内第二信使cAMP和cGMP的功能。cAMP和cGMP作为神经递质、激素、光和气味等物质的第二信使，广泛作用于细胞内的靶器官，当外来信号经跨膜传递并引起一系列生理反应使核苷酸环化酶激活后，cAMP和cGMP产生，磷酸二酯酶降解细胞内的cAMP和cGMP，从而终止这些第二信使传导引起的生化作用。cAMP作为激素的第二信使激活蛋白激酶，使代谢酶活性增强，从而加强体内蛋白的合成，增快动物的生长速度；诱导激素(如生长激素等)或酶的合成，促进机体的合成代谢。谷金妮等[9]研究证明，提高骨骼肌细胞内cAMP的水平，可以引起骨骼肌蛋白合成增加，促进骨骼肌蛋白的积累。石文贵[10]证明提高成骨细胞内cAMP的含量，则促进成骨性相关因子的表达。肉用家畜的骨架增加则可以提高载肉量，骨骼肌蛋白合成增加能够提高肌肉产量，本研究检测到rs449748996突变位点能显著影响郏县红牛18月龄体高，该位点可以作为郏县红牛18月龄体高的候选基因进行进一步研究。

位于23号染色体的rs210024569位点是影响郏县红牛6月龄体高的潜在显著相关位点(P=9.53E-08)，该位点位于C6orf106基因的第1内含子。C6orf106基因是新近发现的人6号染色体上编码蛋白的基因，其功能还没有完全定论。Weedon[11]证实C6orf106基因突变与成人身高显著相关，Zhao[12]发现该基因突变位点与儿童身高相关，但没有达到显著水平。还有一些研究证明C6orf106基因编码的蛋白可能促进浸润性乳腺癌的肿瘤恶化[13]和浸润性乳腺癌的肿瘤恶化[14]。本研究结果与Zhao的研究结果相似，rs210024569位点是影响郏县红牛6月龄体高但没有达到显著水平，推测C6orf106基因除了与癌症有关外，还可能影响动物骨骼的生长发育，因此也可以作为郏县红牛6月龄体高的候选基因做进一步研究。

位于29号染色体的rs42177491位点与12月龄胸围潜在显著相关(P=2.71E-07)。rs42177491位点位于JAM3(Junctional Adhesion Molecule 3)的第一内含子。该基因编码的蛋白质属交界粘附分子蛋白家族中的一员，该家族炎在症过程中白细胞的趋化和跨血管迁徙的诱导中起着重要的作用，参与肌动蛋白细胞骨架组织细胞粘附调节。众多研究证明该基因与一些疾病相关，JAM3突变引起大脑出血性破坏，室管钙化，先天性白内障[15-16]。本研究通过全基因组关联分析发现该基因突变与12月龄胸围潜在显著相关还需要探索更多的理论和实验来验证。

4 结论

以郏县红牛为研究对象，运用SLAF-seq简化测序技术，通过全基因组关联分析，一共筛选3个与郏县红牛生长性状相关的SNP位点。位于10号染色体LOC100337124基因可以作为郏县红牛18月龄体高的候选基因，位于23号染色体的C6orf106基因可以作为郏县红牛6月龄体高的候选基因。JAM3是否能作为12月龄胸围的候选基因还需要探索更多的理论和实验来验证。