卵类粘蛋白手性固定相拆分异丙嗪对映异构体

刁全平，郭 华，罗维巍，李铁纯，回瑞华，侯冬岩

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)

图1 异丙嗪分子结构式

异丙嗪(promethazine)，又名非那根、抗胺荨，是吩噻嗪类衍生物，属抗组胺药，具有镇吐、抗晕眩及镇静催眠等作用[1-3].异丙嗪为手性分子，在药物中以外消旋体形式存在(分子结构如图1所示).由于药物对映体在药理、毒理和临床疗效等方面存在较大差异[4-8]，目前关于异丙嗪R、S构型对映体不同的药效、毒理研究尚未见文献报道，因此建立异丙嗪对映异构体的手性拆分方法尤为重要.异丙嗪的手性拆分通常采用高效液相色谱法[9]和毛细管电泳法[10]，采用卵类粘蛋白手性固定相拆分异丙嗪对映体尚未见文献报道.卵类粘蛋白是一类新型的蛋白质色谱填料，具有众多手性识别位点和较宽的对映选择范围[11，12]，已被应用于一些药物的手性拆分.本文建立了用卵类粘蛋白柱拆分异丙嗪对映体的高效液相色谱方法,考察了有机改性剂含量、流动相pH值、缓冲盐浓度、流速等因素对异丙嗪对映体分离的影响,优化了最佳分离条件.与其它分离方法比较，该方法分析时间短、重现性好、分析结果可靠，为异丙嗪对映异构体的药理、毒理研究提供一定的支持.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1525高效液相色谱仪；waters 2996型二极管阵列检测器；Agilent Ultron ES-OVM(5 μm,150 mm×4.6 mm)手性柱；PHS-3C精密数显酸度计(上海天达仪器有限公司)；电子天平(AL 204梅特勒-托利多公司(上海)有限公司).

盐酸异丙嗪对照品购自上海江莱生物科技有限公司，纯度98%，批号：100422；甲醇为色谱纯，天津化学试剂有限公司；磷酸二氢钾、磷酸和氢氧化钾等试剂为分析纯，天津化学试剂有限公司；水为二次蒸馏水，实验室自制.

1.2 实验方法

精密称取盐酸异丙嗪对照品，用甲醇溶剂配制浓度为10 μg/mL的测试溶液.色谱条件：甲醇-磷酸二氢钾(0.01 mol/L)=6∶94(V/V)(pH=2.96)为流动相，色谱柱为Agilent Ultron ES-OVM(5 μm,150 mm×4.6 mm)手性柱，流速为0.7 mL/min，检测波长为250 nm，进样量10 μL，HPLC进行测定.

2 结果与讨论

2.1 有机改性剂含量的选择

选择甲醇为有机改性剂，以磷酸二氢钾(0.01 mol/L)为缓冲溶液，流动相pH值为2.96，流速为0.7 mL/min，考察甲醇含量对拆分的影响.随着有机改性剂甲醇含量的增加，样品在固定相上的保留效应减弱，降低了固定相和手性药物的分子作用，拆分效果降低，分离度Rs和选择性系数α都发生变化，结果如图2所示.根据最佳分离效果，选择甲醇-磷酸二氢钾(0.01 mol/L)=6∶94(V/V)为流动相.

2.2 流动相pH值的选择

以甲醇-磷酸二氢钾(0.01 mol/L)=6∶94(V/V)为流动相，用磷酸和氢氧化钾调节磷酸二氢钾溶液的pH值，流速为0.7 mL/min，发现流动相pH值在2.96～3.82范围内时，样品能够得到拆分，结果如图3所示.流动相的pH值能够影响固定相和手性药物的分子状态.异丙嗪在酸性条件下为正离子状态，能够与卵类粘蛋白发生较强的作用力，拆分效果较好.但如果流动相的pH值过低，会破坏手性固定相，对色谱柱产生不可修复的损伤，因此选择流动相的pH=2.96.

图2 甲醇含量对分离度Rs(▲---▲)和单旋体容量因子k1′(◆---◆)的影响 图3 pH值对分离度Rs(▲---▲)和单旋体容量因子k1′(◆---◆)的影响

2.3 缓冲盐浓度的选择

在甲醇-磷酸二氢钾溶液=6∶94(V/V)为流动相、pH值为2.96、流速为0.7 mL/min的色谱条件下，考察不同浓度的磷酸二氢钾缓冲溶液对异丙嗪对映体拆分的影响，结果如图4所示.当缓冲溶液的pH值不变，缓冲盐的浓度会影响固定相的离子效应，影响手性固定相的手性拆分能力.当使用0.01 mol/L的磷酸二氢钾作缓冲溶液时，异丙嗪的手性拆分效果较好.

2.4 流速的选择

以甲醇-磷酸二氢钾(0.01 mol/L)=6∶94(V/V)(pH=2.96)为流动相，考察不同流速对拆分的影响，结果如图5所示.当流动相流速为0.7 mL/min时有最佳的分离效果.

图4 缓冲盐浓度对分离度Rs(▲---▲)和单旋体容量因子k1′ (◆---◆)的影响 图5 流速对分离度Rs(▲---▲)和单旋体容量因子k1′ (◆---◆)的影响

2.5 异丙嗪手性拆分色谱图

图6 盐酸异丙嗪手性拆分色谱图

按照步骤2.1～2.4所确定的实验条件对异丙嗪对映体进行手性拆分，结果如图6，Rs=1.417.

3 结论

异丙嗪分子含有吩噻嗪、胺基、甲基等基团，能与卵类粘蛋白手性固定相的胺基、羰基、羟基等基团发生三点作用而被拆分.有机改性剂的含量影响了样品在固定相上的保留，合适的比例对手性拆分的效果非常重要.流动相pH值影响固定相和样品分子的存在形态和基团特性，在拆分过程中需要选择合适的流动相pH值.本文建立了采用卵类粘蛋白手性拆分异丙嗪对映异构体的方法，可以用于异丙嗪光学异构体药理、毒理等临床研究，还可以对其药物代谢等生理作用的研究提供一定支持.卵类粘蛋白官能团种类多，包括多种极性基团、非极性基团，并且具有立体结构丰富、能够与手性药物等发生多种包合和络合等作用，手性识别位点多，对手性药物具有强大的拆分能力，在手性拆分领域具有广泛的应用前景.