高通量测序在脓毒症患者病原体检测和治疗中的应用

曹燕　刘易林　李莉　李晓勇　孙烨　钟利民　谢恒　刘科成

[摘要]目的 探讨高通量测序技术在脓毒症患者病原体检测和治疗中的应用价值。方法 选取2016年7月～2019年3月我院重症监护病房（ICU）收治的92例脓毒症患者作为研究对象，按照随机数字表法将其分为观察组（47例）和对照组（45例）。对照组给予常规血液培养进行病原体检测，观察组在常规血液培养的基础上联合高通量测序进行病原体检测。比较两组的病原体检测情况（病原体阳性率、病原体报告时间及病原体检出类型）、治疗情况及ICU治疗期间并发症的发生情况。结果 64例患者病原体检测阳性，其中观察组45例，阳性率为95.7%;对照组19例，阳性率为42.2%。观察组的病原体阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组的病原体报告时间为（2.2±0.3）d，对照组的病原体报告时间为（2.6±0.4）d;两组的病原体报告时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。经ICU治疗后，73例患者存活，其中观察组43例存活，存活率为91.5%，对照组30例存活，存活率为66.7%;观察组的存活率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组的ICU治疗时间为（10.5±2.1）d，对照组的ICU治疗时间为（18.1±1.2）d。观察组的ICU治疗时间短于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。在ICU治疗期间，两组的急性肾损伤、低血压和急性肺损伤发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 在脓毒症病原体检测和治疗过程中应用高通量测序技术效果良好，可显著提高膿毒症病原体检测阳性率，缩短脓毒症患者在ICU的治疗时间，同时可明显改善脓毒症患者的治疗预后，值得临床推广。

[关键词]高通量测序;血液培养;脓毒症;病原学

[中图分类号] R631          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）11（c）-0008-04

Application of high-throughput sequencing in the pathogenic detection and treatment of patients with sepsis

CAO Yan   LIU Yi-lin   LI Li   LI Xiao-yong   SUN Ye   ZHONG Li-min   XIE Heng   LIU Ke-cheng

Department of Critical Care Medicine， Yuebei People′s Hospital， Yuebei People′s Hospital Affiliated to Shantou University Medical College， Guangdong Province， Shaoguan   512026， China

[Abstract] Objective To investigate the application value of high-throughput sequencing （HTS） in the pathogenic detection and treatment of patients with sepsis. Methods A total of 92 patients with sepsis treated in intensive care unit （ICU） of our hospital from July 2016 to March 2019 were selected as the research object. According to the of random number table method， the patients were divided into the observation group （47 cases） and the control group （45 cases） .The control group was treated with conventional blood culture （BC） for the pathogenic detection， and the observation group was treated with conventional BC combined with HTS. The pathogen detection （pathogen positive rate， pathogen reporting time and pathogen detection type）， treatment status and complications during ICU treatment were compared between the two groups. Results The pathogens were positive in 64 patients， including 45 cases in the observation group， 95.7% in the control group and 19 cases in the control group， with a positive rate of 42.2%. The positive rate of pathogen in the observation group was higher than that in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The pathogen reporting time of the observation group was （2.2±0.3） d， and the pathogen reporting time of the control group was （2.6±0.4） d. There was no significant difference in the reported time of pathogens between the two groups （P>0.05）. After ICU treatment， 73 patients survived， of which 43 patients survived in the observation group， the survival rate was 91.5%， and 30 patients in the control group survived with a survival rate of 66.7%. The survival rate of the observation group was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The ICU treatment time of the observation group was （10.5±2.1） d， and the ICU treatment time of the control group was （18.1±1.2） d. The ICU treatment time of the observation group was shorter than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the incidence of acute kidney injury， hypotension and acute lung injury between the two groups during ICU treatment （P>0.05）. Conclusion The application of HTS in the detection and treatment of patients with sepsis has good clinical effects. It can significantly improve the positive rate of pathogen detection， shorten the treatment time in ICU， and improve the prognosis of sepsis patients. It is worthy of clinical application.

[Key words] High-throughput sequencing; Sepsis; Pathogenic detection; Treatment

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，可发展为严重脓毒症和脓毒症休克，甚至导致患者死亡[1-2]。菌血症是脓毒症的主要致病因素之一，但并非所有的血流细菌感染都会导致脓毒症，除细菌之外，真菌、病毒、寄生虫等其他病原体均可导致患者严重感染及脓毒症。目前，脓毒症的病原学诊断主要依赖于血液培养（blood culture，BC），同时BC在临床上依然被认为是诊断脓毒症的金标准，但耗时长，诊断阳性率较低，且并非所有的病原体都能被培养出，尤其对于已使用过抗生素的患者，阳性率明显降低，使得BC具有明显的局限性，对脓毒症患者造成不必要的经济负担，甚至死亡[3-4]。近年来，高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS），又称二代测序技术（next generation sequencing，NGS），可以使病原体在检测前不需培养分群即可直接测序鉴别，具有检测速度快、准确率高、覆盖范围广等特点，在临床病原学诊断和医学研究领域显示出良好的应用前景[5-6]。目前，HTS应用于脓毒症病原学诊断和治疗的前瞻性研究报道少见。本研究旨在探讨HTS在脓毒症患者病原学诊断及指导脓毒症抗感染治疗中的应用价值，为脓毒症的临床诊治提供参考依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年7月～2019年3月我院重症监护病房（intensive care unit，ICU）收治的92例脓毒症患者作为研究对象，采用前瞻性临床对照研究方法，按照随机数字表法将其分为观察组（47例）和对照组（45例）。观察组中，男30例，女17例;年龄9～82岁，平均（64.8±14.6）岁;病情严重程度;普通脓毒症40例，重度脓毒症5例，脓毒性休克2例。对照组中，男28例，女17例;年龄11～84岁，平均（65.4±14.9）岁;病情严重程度;普通脓毒症39例，重度脓毒症4例，脓毒性休克2例。两组患者的性别、年龄、病情严重程度等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。纳入标准：①经临床诊断确诊为脓毒症患者[1];②首次入住ICU;③自愿参与研究。排除标准：①合并恶性肿瘤;②近半年内接受过免疫抑制剂治疗;③不配合研究者。所有患者及其家属知情同意本研究并签署知情同意书。本研究所涉及的研究方法均遵循《赫尔辛基宣言》，符合医学伦理学原则，并获得粤北人民医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

对照组给予常规BC进行病原学检测，观察组在常规BC的基础上联合HTS进行病原学检测。患者入ICU后，在静脉应用抗菌药物抗感染前，严格按照采血流程及规范，采取对照组患者10～20 ml血液标本送至我院检验科行BC进行病原学检测，观察组在对照组基础上另抽取5～10 ml血液样本保存于4℃环境中，由快递寄往深圳华大基因研究所进行HTS。两组脓毒症患者行BC后即予注射用亚胺培南西司他丁钠（瀚晖制药有限公司，国药准字H20067765，生产批号18040401，规格1.0 g/瓶，q 8 h）联合注射用万古霉素（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，国药准字H20033366，生产批号117190505，规格0.5 g/瓶，q 12 h）抗感染治疗，同时两组患者均给予脓毒症常规治疗，包括针对原发病的治疗、液体复苏、营养支持、控制血糖、预防应激性溃疡及对症支持治疗。待BC及HTS检测结果报告后予抗感染药物。如对照组患者BC结果提示阴性，则再次抽血行HTS。所有脓毒症患者抗感染治疗连续1周后，再次采血行BC或HTS（复查），如患者感染得到控制，病情稳定，同时一次HTS阴性或连续两次BC阴性后，予出院或转入其他专科进一步治疗相关疾病，患者出ICU后均连续随访不少于3个月，每次随访详细了解患者感染有无加重或复发、生活质量及并发症情况。

1.3观察指标及评价标准

比较两组的病原体检测情况（病原体阳性率、病原体报告时间及病原体检出类型）、治疗情况及ICU治疗期间并发症的发生情况。

①病原学检测阳性率=病原体阳性例数/该组患者总例数×100%;②病原体报告时间指患者的病原体检测结果报告日期-采血日期，d）;③病原体检出类型包括：细菌、真菌、病毒及其他微生物;④患者的并发症情况包括急性肾损伤、低血压及急性肺损伤。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组患者病原体检测情况的比较

92例脓毒症患者中，观察组患者45例病原体检测阳性，对照组患者19例病原体检测阳性。观察组患者的病原体阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。两组患者的病原体报告时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组患者的细菌、真菌和其他微生物检出率比较，差异无统计学意义（P>0.05），但观察组患者的病毒检出率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。

2.2两组患者治疗情况的比较

经ICU治疗结束后，观察组患者出院3例，转科40例，存活43例;对照组患者出院1例，转科29例，存活30例。观察组患者的存活率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。观察组患者的死亡率低于对照组，差異有统计学意义（P<0.01）;观察组患者的ICU治疗时间明显短于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。

2.3两组患者ICU治疗期间并发症发生情况的比较

两组患者在ICU治疗期间的急性肾损伤、低血压和急性肺损伤发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

3讨论

脓毒症是指明确或可疑的感染引起的全身炎症反应综合征[1，7]。随着人口老龄化的加剧、肿瘤发病率上升及侵入性医疗手段的增加，脓毒症的发病率不断上升，全球每年新增数百万脓毒症患者。国外流行病学结果显示，脓毒症发病率为0.3%，约9%发展成严重脓毒症，3%发展为脓毒性休克，是导致ICU患者死亡的主要原因之一[8-9]。严重脓毒症和脓毒性休克是ICU面临的重要临床问题。研究发现，脓毒症患者治疗前，血清中降钙素原（PCT）和C反应蛋白（CRP）水平高于非脓毒症感染患者，同时，严重脓毒症和脓毒性休克患者PCT和CRP水平高于脓毒症患者（P<0.05）。通过PCT和CRP联合动态检测，可提高脓毒症诊断的敏感度和特异度，同时有助于判断脓毒症患者病情的严重程度[10-11]。脓毒症的治疗重在及时，如在入院1 h内得到正确的诊治，患者的存活率将达到80%以上;而患者在6 h之后才被诊治，患者的生存率即会下降至30%[12]。脓毒症的早期抗感染治疗非常重要，2014年《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南》强调，患者应在入院1 h内开始有效的静脉抗感染药物治疗[1]。如何合理使用抗菌药物，既缩短抗菌药物应用时间，又不降低治疗有效率，是目前临床工作中面临的主要问题。目前临床上脓毒症的病原学诊断主要依赖于BC，但耗时长，陽性率较低，且并非所有的病原体都能被培养出，具有明显的局限性[3-4]。

如何早期、快速、准确地查找出脓毒症患者感染的病原体，实施早期精准的抗感染治疗，是长期困扰ICU医生的一个难题。自2016年7月开始，本研究采用HTS对传统的脓毒症病原学诊断方法进行了改良，在常规BC的基础上联合HTS，取得了良好的结果。观察组患者的病原体检测阳性率达95.7%，明显高于单纯BC组，差异有统计学意义（P<0.01）。同时，本研究结果提示，BC联合HTS可明显缩短脓毒症患者在ICU的治疗时间，观察组的ICU治疗时间明显短于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。同时，本研究结果进一步提示，BC联合HTS可明显改善脓毒症患者的治疗预后，观察组患者的存活率达91.5%，明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。在脓毒症患者的病原学诊断中，BC联合HTS可明显提高病原体检测的阳性率，这可能与HTS从整体上把握病原微生物群体的组成情况，也可获得含量低的病原序列，并通过未知序列鉴定新物种有关，可以迅速识别各类病原微生物，使诊断时间缩短，诊断结果更加精确[13]。HTS目前可检测出约2700余种病原体，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体、立克次体，具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖度广及产出巨大等特点[5-6]，特别是病毒，支原体、衣原体等少见病原体类型的病原学诊断，HTS较BC而言具有更加独特和明显的优势[7，14-15]。在脓毒症患者的治疗中，BC联合HTS可明显缩短脓毒症患者在ICU的住院治疗时间，同时可明显改善患者的治疗预后，这可能与HTS能快速准确地查找出脓毒症患者感染病原体，指导ICU医生实施早期精准的抗感染治疗有关，从而能在较短的时间内有效控制患者的感染，降低严重脓毒症和脓毒性休克的发生率，同时降低急性肾损伤、急性肺损伤等并发症的发生率[16-18]，从而提高脓毒症患者的存活率，缩短脓毒症患者在ICU的治疗时间。

综上所述，在脓毒症病原学诊断和治疗过程中应用高通量测序技术效果良好，可显著提高脓毒症病原体检测阳性率，明显缩短脓毒症患者在ICU的治疗时间，同时可明显改善脓毒症患者的治疗预后，值得临床推广。

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（收稿日期：2019-08-08  本文編辑：焦曌元）