氧化应激在年龄相关性耳聋中的作用研究进展

于慧柠 郑体花 郑庆印

滨州医学院(烟台264003)

随着经济发展和医疗技术进步，人们的生活水平日益提高，人均寿命不断延长，随之而来的是人口老龄化和年龄相关性疾病发病率的升高。年龄相关性聋 (Age-related hearing loss，ARHL)是其中所占比重较大的疾病之一。美国最新人口普查数据显示，到2030年65岁以上人口数量将达到7300万。其中有4100万人会存在听力损失，占65岁以上人口的56.2%[1]，其中，65岁以上人群中的发病率约25%-40%，75岁以上人群发病率为40%-66%，而85岁以上的人群发病率高达80%[2]。据报道，2025年到2040年之间，我国老年人口将从2.84亿达到4亿，其中有11.04%为听力残疾，致残原因中，ARHL占66.78%[3]。耳聋不仅影响了患者本身的生活质量，使患者变得孤立、抑郁，同时由于沟通困难失去生产力而对社会造成的间接损失也不容忽视[4]。目前为止，听觉辅助装置是防治ARHL最主要的方法，但由于其价格因素，在国内老年性聋人群中应用明显受限[5]。因此，加快寻找明确的发病机制是研究防治ARHL的重要途径。氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）过量累积导致衰老性疾病的理论在很多研究中得到了共识，在ARHL发病机制的研究中氧化应激通路也受到了广泛关注。

1 氧化应激与衰老

氧化应激产生的自由基包括氧自由基和氮自由基，其中对ROS的研究相对较多。ROS可产生于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原反应、一氧化氮合成中，也可产生于线粒体、微粒体、过氧化物酶进行正常生理活动的进程中。尽管低浓度的ROS对机体传递能量、保持活力、杀死细胞、消除炎症和分解毒素等而言是必须的，但异常高水平的ROS则变成“污染物”[6]，机体内抗氧化酶和ROS的平衡被打破可引起组织的病理改变。在组织内ROS可使酶失活，破坏DNA成片段，攻击不饱和脂肪酸，形成脂质过氧化物，形成的脂质过氧化物又可以引发临近的不饱和脂肪酸的链式反应，通过与脂质、蛋白质、核酸反应，抑制DNA复制及转录并产生乙二醇胸腺嘧啶及8-脱氧鸟苷，两者都是氧化性DNA损伤的直接产物[7]。

ROS过量累积导致衰老性疾病的理论在很多研究中得到了共识，如：糖尿病、癌症、心血管疾病、帕金森病和阿尔茨海默病等[8]。研究表明，过量累积的ROS也是导致应激介导的耳聋的重要病理机制[9]，如噪音性聋[10]、药物性聋[11]、耳鸣[12]、老年性聋。机体无时无刻不存在ROS的产生，即便是身体状况一直健康的老年人在65岁之后也会出现耳聋的症状，这说明随着年龄的增长而累积的ROS与ARHL的发生密切相关。因此ROS介导的氧化应激是研究ARHL必不可少的通路。

2 年龄相关性聋

ARHL临床上又称老年性聋（Presbycusis），发病从高频听力损失开始，逐渐累积低频听力，以听觉灵敏度降低为主，伴随着言语识别力的下降，是双耳对称出现并缓慢发展的一种疾病，其具体的分子机制目前尚不清楚，被认为是一种多因素共同作用的疾病，致病危险因素包括外因(噪音，药物，创伤，血管损伤，代谢变化和免疫系统疾病)、内因、遗传、基因等[13,14]。Schuknecht[15]提出的临床常见的四种主要类型的ARHL，每一种都有不同的听觉表征：1.感音性：耳蜗底回毛细胞退行性变，高频听力损失；2.神经性：螺旋神经节神经元丢失，言语识别力降低；3.代谢性：血管纹萎缩，纯音听力图低平；4.机械传导性：基底膜柔韧性降低，能量的机械传导受损。在这4种类型独立的分型比较少见，大部分ARHL的临床类型是两种或者两种以上的混合类型，这样的分型与其病理分型有关。ARHL的病理学特点包括毛细胞丢失、血管萎缩、螺旋神经节神经元的丧失以及中枢听觉通路的退化，大多数的ARHL病例都是这些病理变化的混合物[16]。

目前的研究表明，氧化应激和mtDNA损伤是ARHL的重要机制之一[9,17]，二者相辅相成，相互联系共同作用于毛细胞的凋亡过程。有学者认为氧化应激产生大量的ROS,ROS诱导细胞凋亡又分为内、外两种途径[18]，细胞外途径即ROS直接损伤细胞，通过刺激细胞外的跨膜受体激活Caspase8和下游的Caspase3启动了细胞凋亡；细胞内途径则通过线粒体发挥损伤作用，线粒体除了细胞膜通透性改变，激活了Caspase9和其下游效应因子细胞色素酶c引起细胞凋亡外，还释放了大量的ROS，如此恶性循环加重了听觉感受细胞不可逆凋亡的进程，使得ARHL一旦发生便无法逆转[18]。

3 氧化应激与ARHL的研究进展

3.1 氧化应激与ARHL

如前所述，ARHL的发生与毛细胞和螺旋神经节不可逆的凋亡密切相关[16]。目前多数实验数据表明，ARHL的患者或动物模型体内氧化应激相关蛋白或因子的表达量升高而抗氧化相关蛋白或因子含量明显下调，证实了ARHL与氧化应激存在一定的密切关系。

Neri等[19]在老年耳聋患者颈静脉中检测到高水平表达的丙二醛（MDA）和4羟基壬烯酸（4-HNE），而这两个指标是反映氧化应激水平的标志物，表达量升高可能与内皮组织易遭受氧化应激产物攻击有关；Jiang等[20]利用谷胱甘肽共轭标记蛋白监测到H2O2介导的氧化应激水平在CBA∕J小鼠12月龄表达升高，4-HNE、硝基酪氨酸（3-NT）等羟自由基和过氧硝酸盐的产物在18月龄表达升高，23月龄后在螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带被检测到。除了ROS外，NOS也与ARHL有关，NO是一种潜在的神经毒素，过量产生的NO可作为自由基本身或在诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric-Oxide Synthse，iNOS）作用下与O2-结合形成过氧亚硝基，老龄的大鼠耳蜗中iNOS的表达量明显高于幼龄鼠[21]。

与氧化应激相关因子表达上调相反的是，抗氧化系统相关因子在老年性耳聋发生时其表达量明显下调，例如在Jiang等[20]的实验中观察到凋亡诱导因子和超氧化物歧化酶在CBA∕2J小鼠18月龄Corti氏器和螺旋神经节中表达量下降。Liu等[22]认为正常情况下耳蜗中存在两类抗氧化酶：与谷胱甘肽还原酶代谢相关的谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPX1)、谷胱甘肽还原酶(GSR)和谷胱甘肽转移酶(GST)；与分解超氧阴离子和过氧化氢相关的过氧化氢酶（CAT）和Cu∕Zn超氧化物歧化酶（SOD1），如果抗氧化酶功能受损则会导致细胞损伤。动物实验证明，敲除Gpx1和Sod1基因的小鼠模型对年龄相关性聋和噪音性聋更易感[23-25]。GST是已知的由多个基因编码的、发挥抗氧化作用和解毒作用的超家族酶的总称，可能也发挥了保护毛细胞的作用[26]，其中GSTM1和GSTT1是GST家族系统遗传学的主要研究对象，编码GSTM1和GSTT1的基因在人群中存在基因变异，多达50%的ARHL人群存在GSTM1无效表型[27]，这种突变使得抗氧化酶与代谢产物无法准确结合，导致基因突变携带者更容易遭受氧化应激损伤，而且GSTM1基因突变携带者与正常人相比，高频听力的振幅更小，因而可能更易感年龄相关性聋[28]。除此之外，维生素A和锌具有抗氧化衰老的功效，Lasisi等[29]研究了126例老年性耳聋患者的血清发现，高频听力损失的老年性耳聋患者血清里的维生素A和锌的含量显著降低。

正常情况下机体产生的ROS能被内源性抗氧化酶如过氧化物歧化酶、谷胱甘肽等清除，从而保持组织所处微环境的稳态[30]。随着年龄的增长，衰老打破了这个平衡，使得ROS不能被充分清除，过量积累的ROS攻击靶点线粒体，造成线粒体内膜的损伤，影响跨越线粒体膜的质子浓度梯度，使线粒体合成ATP的功能受损；同时，线粒体功能受损使生成的ROS增多，不能被及时清除，造成生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损伤生物膜通透性，引起电子传递连的活性进一步下降，形成的恶性循环最终引起细胞凋亡[31]。因此，氧化应激不仅能直接造成毛细胞凋亡，还能通过攻击线粒体造成损伤。

3.2 mtDNA损伤与ARHL

线粒体功能紊乱在听力损失中的作用得到了证实：Sediman等[7]在老年性耳聋患者的颞骨切片中检测到了mtDNA的缺失；我国学者韩维举等[32]通过采用基因重组，聚合酶链式反应等技术，检测到老年性耳聋患者组和老年正常听力组mtDNA4977表达量存在差异，老年性耳聋患者组mtDNA4977的缺失率明显高于老年正常听力组，两组数据具有统计学差异。刘俊等[33]在Wistar大鼠模型上检测mtDNA4977同源基因mtDNA4834发现，与青年大鼠相比，老年大鼠耳蜗螺旋神经节和耳蜗核中mtDNA4834缺失率分别为66.7%和100%，而青年大鼠无mtDNA4834的缺失。

考虑到以人为老年性耳聋疾病研究对象的局限性，建立相关动物模型更利于研究。动物实验证明，敲除与线粒体相关的某些因子后，实验动物的听力与正常组相比明显下降[34]，例如mtDNA聚合酶Polg负责线粒体的复制和修复，Polg基因敲除的小鼠衰老速度要明显快于正常小鼠，同时伴有听力损失[35]。谷胱甘肽过氧化物酶1（Gpx1）通过降低过氧化氢的含量而在线粒体抗氧化防御中发挥重要作用，Gpx1基因敲除小鼠与正常小鼠相比更易感噪声性聋。除了上述的动物模型以外，长期注射D-半乳糖(D-gal)的大鼠最近被用作老化或抗老化药理学研究的动物模型[36]。长期注射D-gal可以诱导mtDNA4977缺失，模仿哺乳动物的自然老化过程[37]。Chen等[38]认为D-gal诱导的老化大鼠模型内耳的抗氧化酶活性降低，脂质过氧化显著，听力水平较正常大鼠明显降低。此外，在老化大鼠模型的听觉皮层、耳蜗核和下丘上也发现了mtDNA的缺失。众多对mtDNA突变的研究显示，线粒体功能紊乱严重影响了听力水平。

那么ROS的产生和线粒体损伤存在怎样的联系呢？

线粒体是有氧活动的供能者和细胞死亡的调解者。它既可以利用氧进行氧化磷酸化形成ATP供能，又是ROS损伤的靶点，还能在此过程中产生ROS破坏细胞[31]。人类的每个细胞都含有大量的线粒体，毛细胞、螺旋神经节细胞和血管纹中的含量更多，是高氧代谢需求器官，且毛细胞和螺旋神经节细胞均为终端分化细胞，数量有限且不可再生，mtDNA突变极易在这两种细胞中累积[39]。随着年龄增加和机体衰老的发生，内耳供血供氧不足，线粒体作为有氧代谢的主要场所对缺血缺氧十分敏感，加上局部ROS的大量累积，线粒体功能受损明显，起初ATP产生低下，依靠ATP的生理活动受抑制，离子运输紊乱、声信号转导效率降低，听觉出现异常；随着mtDNA突变率增加，最终启动了细胞凋亡程序导致了毛细胞、螺旋神经节细胞凋亡[40]，造成了ARHL不可逆转的发生。Someya[41]的实验也验证了ROS和mtDNA损伤的存在一定联系，过表达线粒体过氧化氢酶的转基因小鼠（MCAT）与正常野生型小鼠相比毛细胞缺失率下降，DNA损伤减少，ARHL的发病时间明显延缓。

4 抗氧化剂与ARHL

无论是ROS的直接作用还是通过损伤mtDNA间接诱导细胞凋亡，多数研究证实了ROS参与并介导了ARHL的发生发展，那么阻止或延缓ROS的过量积累也许是预防或治疗ARHL的一种方法。

预防ARHL是一个相对较新的研究领域。在过去的几年里，研究人员试图阻止或减缓ARHL的发病或进展，主要方法包括增强机体内抗氧化防御系统能力和增加外源性抗氧化剂。关于补充抗氧化剂干预ARHL的基本观点来自于几个以人群为对象的研究，这些研究表明饮食中的维生素摄入量与ARHL的患病率有显著的相关性[42]。然而更多的抗氧化剂的听力保护作用实验还是以动物模型作为研究对象。Seidman曾进行过一项随机前瞻性研究[43]，对344只Fischer大鼠持续喂养维生素E（VE）、维生素C(VC)、拉扎洛依（预防阿尔兹海默症药物）和褪黑素，观察小鼠体内抗氧化水平和听力损失情况，发现喂食抗氧化剂的动物听力水平要高于正常喂食的动物。VE是一种有效的脂溶性抗氧化剂，易提供氢原子来终止氧化链式反应，且对保护循环脂蛋白以及细胞膜的正确功能和稳定性也至关重要。VC或抗坏血酸是一种水溶性维生素，它是超氧化物、硫醇、单基氧和羟基自由基的有效清除剂。褪黑素能直接中和羟基自由基和过氧化自由基，还能通过激活GSH过氧化物酶，抑制一氧化氮合酶的活性，起到间接抗氧化的作用。拉扎洛依通过抑制脂质过氧化、维持细胞膜中VE含量、增加细胞表面黏度等来增加细胞膜的稳定性。2002年Seidman等[44]又探讨了卵磷脂与ARHL的关系。卵磷脂是一种多不饱和的磷脂酰胆碱，它在激活大量的膜定位酶中发挥限速作用，其中包括SOD和GSH，是保护细胞膜免受ROS损伤的重要抗氧化剂。Seidman指出，所有抗氧化剂治疗组，包括VE、VC、褪黑素、拉扎洛依、以及卵磷脂，都有较好的听觉敏感性，与安慰剂组相比，mtDNA缺失的更少。补充VC的实验组动物听阈甚至下降了10dB。另有研究表明，抗氧化剂α-硫辛酸和辅酶Q10可减少耳蜗毛细胞的死亡并有效预防或延缓老年性耳聋的发生[45,46]。α-硫辛酸是一种亲脂的自由基清除剂，具有低毒性和高渗透性，易穿过血脑屏障，能明显降低Wistar大鼠内耳mtDNA4834 bp的缺失，提高了老年受试鼠的听力水平；辅酶Q10是一种线粒体辅酶，对ATP的产生至关重要。最新研究发现，给Ggt1dwg∕dwg小鼠喂食N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可有效保护毛细胞，延缓毛细胞的凋亡[47]。NAC具有较强的抗氧化性能，能有效清除活性氧。NAC还上调了GSH和谷胱甘肽过氧化物酶的含量，通过防止脂质过氧化而抑制了ROS的生成。另外，某些具有抗氧化作用的中药成分也用来研究对ARHL的预防作用，例如，葡萄籽提取物低聚原花青素对Wistar大鼠老年性耳聋的发生具有延缓作用[48]。因此，以氧化应激为靶点的抗氧化药物也许能为延缓ARHL寻找新的治疗方法。

虽然目前已经构建了大量的动物模型来寻找ARHL最佳的预防和治疗策略，但是不同鼠种模型之间存在高度变异性，目前尚不清楚哪一类模型与人类老年性耳聋最相似。抗氧化剂治疗ARHL在人群中的首次研究是在一组40人的老年人中进行的[49]，研究表明实验组人群在服用VE和VA 28-48天后听力得到了改善。另有一项临床试验数据显示，在服用VC 8-52周后服药组的听力损失要比对照组低约5 dB。Durga等[50]对728名ARHL患者中进行了3年的跟踪试验发现，服用叶酸组的患者与对照组患者相比，低频听力阈值有细微的差异，且具有统计学意义。

抗氧化剂治疗ARHL真的有效吗？纵观近几年的研究发现，虽然大多数实验表明，补充抗氧化剂可以有效延缓ARHL的发展，但仍有部分实验数据表明抗氧化剂的作用并不显著。Kashio等[51]的实验表明，即使给C57BL∕6小鼠补充了抗氧化剂VC，也并没有在小鼠的耳蜗内检测到VC浓度的提高，也没有观察到ARHL的延缓。Bielefeld等[52]设计不同剂量的抗氧化剂乙酰肉碱对Fischer 344∕NHsd大鼠进行试验，结果证明，乙酰肉碱并不能改善ARHL。Polanski在一项双盲随机临床试验中，对银杏干提取物、α-硫辛酸、VC、VE的抗氧化效果进行对比，发现实验组人群听力阈值与安慰剂组的相比并没有统计学差异[53]。分析这些差异的原因，可能与实验所用模型、抗氧化剂药物特性、给药剂量、给药持续时间等都有关系。

5 总结与展望

氧化应激是大多数衰老性疾病的共同通路，但其确切的发病机制仍不清楚。近年来随着新技术的出现，基因治疗和干细胞治疗发展势头迅猛，基础的药物治疗研究并没有太多进展，美国NIDCD发布的2017-2021年工作指南中提出寻找ARHL的发病机制仍是未来听力研究方向的重点。因此探索氧化应激通路在ARHL发病中的明确机制具有重要意义。