脉冲激光刺激听神经机制的研究进展

张建张开银邱建新余绍宸姚昆*

1安徽医科大学附属阜阳医院（阜阳236000）

2阜阳师范学院物理与电子工程学院（阜阳236000）

聋病在世界范围内发生率较高，可由遗传、感染、药物及免疫等多种因素引起，据世界卫生组织统计，全球约有3.6亿人患有听力障碍，给社会和家庭带来了沉重负担[1]。对于轻度-中度听力下降患者，可通过佩戴助听器改善听力，但对于重度和极重度感音神经性聋患者，目前只能通过电子耳蜗植入获得听力。电子耳蜗通过植入电极，使用一定幅度电流脉冲刺激耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons,SGNs)，产生听觉，是目前重度及极重度听力下降患者的主要治疗方式，帮助患者提高安静环境下言语识别能力。但由于电子耳蜗的电流扩散效应明显，且其电极数目少和空间选择性低，影响了患者的言语识别能力进一步提高[2,3]，人们早就发现许多耳蜗植入患者在噪音环境下言语识别能力改善有限，且不能欣赏音乐[4]。

激光刺激听神经是一种依赖脉冲红外激光能够可逆性地刺激并引发动作电位的新型声电转化方法，具有空间选择性高、没有刺激伪迹等优点[5]，已逐步成为近年来国内外研究重点。已在包括听神经、视神经和坐骨神经等[6-9]多种神经刺激实验中得到证实。其中Richter等[10]和Lenarz等[11,12]曾用脉冲激光分别刺激沙鼠的螺旋神经节细胞和骨螺旋板，记录激光刺激产生的耳蜗复合动作电位（OCAP)和听性脑干反应（OABR），结果均表明脉冲激光能够触发神经冲动。在空间选择性研究方面，Richter实验室曾分别采用免疫组织化学染色法[5]、光音掩蔽法[13]和下丘测量法[13,14]，证实了脉冲激光诱发听神经冲动具有良好的空间选择性。

1 激光刺激听神经引起神经冲动的机制

目前认为首先是由于激光辐射引起局部温度瞬间升高[15-18]。具体过程较为复杂，一些学者主张光声效应，认为激光辐射组织产生压力波，刺激耳蜗毛细胞产生神经冲动[19-21]，在Thompson AC等[22]的研究中，作者分别采用光刺激、声刺激和电刺激研究三种刺激方式在正常、急性致聋（打开蜗窗和前庭窗，通过圆窗及前庭窗轻轻吸入新霉素(10 mg∕ml-1)，使蜗顶区暴露于新霉素，至少重复三次，以确保彻底的耳毒素暴露。）和慢性致聋（实验前4周，在气体麻醉下，联合使用呋塞米(130 mg∕kg）静脉注射和卡那霉素(420 mg∕kg）皮下注射，测定动物听力，以听阈提高50分贝作为极重度聋的标准。)豚鼠中引起的听性脑干反应，研究发现，在两种致聋模型豚鼠致聋前将光纤插入豚鼠耳蜗中，即使光纤方向不朝向螺旋神经节细胞（SGNs)，可引出与声刺激相似的波形图；但在致聋后，即使光纤方向朝向SGNs，仍不能引出光刺激脑干诱发电位（oABR)。而此时若使用电极刺激致聋后豚鼠耳蜗，却可引出电刺激脑干诱发电位（eABR)，作者认为，激光刺激产生听觉冲动需要有功能的毛细胞参与，激光辐射引起组织产生压力波震动毛细胞，产生神经冲动。Rettenmaier A[23]等采用膜片钳技术，分别对离体Sprague-Dawley大鼠螺旋神经节细胞、转染CLC-4通道蛋白的HEK 293细胞和未转染的HEK 293细胞（对照组）进行了单细胞记录，结果表明，激光刺激导致细胞产生内向电流，这些电流大小与激光脉冲能量成线性关系，导致细胞去极化。但这种去极化效应很小，在波长为1450 nm的25µJ脉冲能量照射下，螺旋神经节神经元的去极化效应最大仅为(1.2±0.9)mV，不足以引起动作电位。Xia[24]等通过研究证实激光刺激可以在耳蜗内可以产生压力波，当脉冲激光能量为17µJ/pulse刺激耳蜗时，外耳道压力为43.5dB(re 20 uPa)，计算出相应的内耳压力约为78.5dB(re 20 uPa)；在能量为164μJ∕pulse脉冲激光下，耳道内压力平均为63 dB(re 20 uPa)，内耳压力为98 dB(re 20 uPa)，而且，压力值大小与光束路径是否朝向螺旋神经节细胞无关。

光热效应主张者认为激光辐射导致神经组织局部温度升高，引起神经组织表面发生一系列变化，产生动作电位（AP)。瞬态电压感受器阳离子通道（TRP）的激活是引发AP的重要环节，免疫组化染色检查发现螺旋神经节细胞表达TRPV-1和TRPV-4两种离子通道[25,26]。Albet[26]等采用不同类型的离子通道阻断剂，用细胞膜片钳技术记录了视神经和前庭神经细胞在1875毫秒脉冲激光刺激下的反应，发现TRPV-4离子通道是响应激光刺激的主要通道。当激光辐照细胞时，光子被吸收在听觉神经组织内引起局部温度升高，进而触发了TRPV-4离子通道，使Ca2+内流，引起细胞膜去极化，激活钠离子通道，诱发钠离子动作电位，产生神经冲动，国内也有研究与此相符[27]。Suh,Eul[28]采用基因敲除方法制造出缺乏TRPV-1通道小鼠模型进行实验，发现，当激光照射该类小鼠耳蜗时，不能引起听神经冲动。可见，TRPV通道介导听神经红外激光诱发神经冲动反应。

此外，Beier HT[29]等使用原代海马神经元进行实验，采用YO-PRO-1和PI荧光标记的方法，发现激光辐射神经元时，破坏了细胞膜的稳定性，在细胞膜表面形成纳米孔道，允许钙离子内流，激活磷脂酰肌醇（PIP2）通路，而PIP 2是M型KCNQ钾通道活性的中心决定因子[30]，这些通道负责维持神经元的静息膜电位，阻断后可引起持续的膜去极化。Young[31]等在听觉正常、听力受损和听力严重受损的豚鼠中进行了掩蔽实验。在正常听力动物中，激光反应可以被声刺激所掩蔽，随着豚鼠声刺激阈值升高，声刺激对光刺激掩蔽效应逐渐减弱。在听力受损的豚鼠中声刺激阈值显著提高，而光刺激阈值保持不变。通过光-声掩蔽实验，作者认为激光辐射引起神经冲动是激光与神经直接作用的效果，而不是光热效应。

可见，光声效应与光热效应主要区别点在于激光辐射引起神经冲动是否需要毛细胞的参与，因各个实验室及实验人员的固有差异，很难做到实验条件的一致性。在豚鼠致聋模型制作上，多采用耳蜗内注入耳毒性药物的方法致聋，以声刺激（声压级多在80dB以上）不能引出豚鼠听性脑干诱发电位为判定标准[32]，但致聋豚鼠模型耳蜗内是否有功能性毛细胞残存，仍不明确。Tan[33]等采用基因工程方法制作出三种致聋小鼠模型：1.Atoh1-CKO型:所有外毛细胞和大部分内毛细胞消失，螺旋神经节细胞（SGNs）消失；2.Neurog1 KI型：保留大部分毛细胞，但其静纤毛未分化，没有听力残存；3.Vglut3-∕-型：有正常数量的毛细胞和SGNs，但却没有正常的神经递质释放。对于Atoh1-CKO型小鼠，由于缺乏毛细胞和SGNs等耳蜗正常结构，实验中光、声刺激均未能引起神经冲动。对于Neurog1 KI型小鼠，当使用波长为1860nm，脉宽为100µs，辐射量为12.3µJ∕pulse的激光刺激，光纤朝向小鼠耳蜗顶转时，可以记录到光致听性反应（oABR)，其波形与正常小鼠在声刺激条件下产生的听性反应（aABR)相似，幅值达1.8±0.6µV，当光纤朝向耳蜗中转或底转时，oABR记录值减小甚至无波形引出。对于Vglut3-∕-型小鼠，采用激光刺激时，从耳蜗底转至顶转均可记录出oABR，诱发的oABR幅值大于Neurog1 KI型，但小于对照组（正常小鼠）。对这些小鼠进行同步X射线微CT成像发现，Atoh1-CKO型小鼠耳蜗的任何位置均未见毛细胞，基底膜扁平，Corti器官（OC）和螺旋神经节细胞缺失。Neurog1 KI型小鼠在耳蜗顶，观察到毛细胞和OC完整的结构，而从耳蜗的中部至底部位，SGN逐渐消失。Vglut3-∕-型小鼠在耳蜗全程均能看到毛细胞和SGN存在，以及连接毛细胞和脑干神经元的神经纤维，但其体积较对照组更小，颗粒更多。这些结果与电生理记录高度一致，因为光刺激引起的神经反应与SGN的存在空间上是相关的。作者认为，激光刺激引起致聋动物产生听觉反应需要靶结构螺旋神经节神经元的存在，内毛细胞与螺旋神经节神经元之间的突触传递是不必要的。

激光刺激产生神经冲动机制复杂，也可能是多重因素共同作用的结果，关添[34]等通过采用光刺激三维仿真实验和活体豚鼠实验，发现激光刺激既可引起温度上升，也可引发光声效应，产生双极性脉冲声波，而980nm激光刺激豚鼠产生了2个听神经复合动作电位，且其幅值不同，前者大于后者，综合考虑实验结果，作者认为脉冲激光刺激听神经可能是光热效应和光声效应的叠加结果。

2 展望

激光刺激诱发听神经冲动的研究逐渐深入，但用于研制光学人工耳蜗仍有许多问题亟待解决。

（1）激光参数：脉冲激光参数主要包括波长、频率、辐射量等，目前研究的激光波长多在1.85µm和1.94µm左右，刺激频率多在300Hz以下，何种频率和波长刺激听神经效果最佳，还有待进一步研究。

（2）目前所进行的动物实验均为单光纤激光刺激耳蜗，有必要开展多光纤植入研究，光纤之间是否会相互影响，还需在动物实验中进一步证实。

（3）目前研究均为动物实验，尚未进行有意义的临床实验，激光刺激引起动物耳蜗温度升高，但在人体耳蜗是否会产生类似效果，其安全性和可行性如何，仍需进一步研究。

（4）电子耳蜗技术成熟，光电联合刺激听神经能否具有更好的效果，这可能也是未来研究的重点方向。

（5）光遗传学利用蓝光照射听神经表达的光敏感通道蛋白（ChR2）（该蛋白通过基因载体转入听神经获得），理论上可增加声音编码的分辨率[35]，也将是未来研究的一个重点。