NMDA受体相关的听觉神经疾病的研究现状

黄喜刘佩强覃丹雪叶文华林晓宇苏纪平*

1广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科（南宁530021）

2武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）耳鼻咽喉头颈外科（武汉430022）

谷氨酸是哺乳动物体内最重要的兴奋性氨基酸递质，主要分布于神经系统，储存于突触前膜囊泡中，释放后与谷氨酸离子型受体和代谢型受体结合，其中谷氨酸离子型受体分为NMDAR、AMPA受体（AMPAR）、海人藻酸受体（KA受体、KAR）。其中NMDAR作为重要的兴奋性氨基酸递质受体，介导一种缓慢而持久的兴奋性反应，广泛存在于中枢神经系统，是突触可塑性、维持神经元生理性突触传递、诱导长时程增强（long term potentiation,LTP）相关功能（学习和记忆）的基础。帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、癫痫等诸多神经系统疾病的发生发展及病理生理过程中也伴随着NMDAR表达的改变。

近年来，NMDAR在听觉系统中的作用的研究日益增加，已发现NMDAR在听觉传导通路的各级神经元均有表达，参与听觉发育[1,2]、神经保护[3-5]、声音定位[6,7]、听觉信号的传递[8,9]等过程。另一方面，也发现NMDAR过度激活与水杨酸钠致耳鸣[10-13]、噪声性听觉损伤[14-17]、老年性聋[18,19]、药物性耳聋[20]等听觉疾病密切相关，是这些难治性耳聋晚期病理的交汇点，也成为突破难治性耳聋治疗的潜在靶点。因此，明确NMDAR在听觉神经系统的分布以及在听觉系统疾病中的作用有助于进一步探讨听觉系统疾病的病理机制，寻找新的治疗靶点，为研发具有靶向性的药物提供理论依据。本文就NMDAR在听觉系统中的分布及NMDAR相关的听觉神经疾病的研究现状进行综述。

1 NMDAR的生理及病理作用

NMDAR由NR1,NR2A-D和NR3A-B这七种同源基因编码的七种亚基组成，在所有的NMDAR亚基中，NR1是构成NMDAR复合物以及实现其离子通道功能的基本亚基，NR2的四种亚基NR2A-2D是NMDAR功能异质性的主要影响因素。兴奋性神经元突触上NMDAR主要由NR1∕NR2A组成或NR1∕NR2A∕NR2B组成[21]。

NMDAR-通道是阳离子通道，除通透Na+和K+外，对Ca2+具有较大的通透性。静息状态下，NMDAR被细胞外的Mg2+阻滞而处于抑制状态，动作电位产生后，神经细胞突触后膜发生去极化，Mg2+抑制解除，在配体作用下，NMDAR通道开放，Ca2+等阳离子内流。NMDAR作为中枢神经系统中正常的兴奋性氨基酸受体的一种，具有诱导长时程增强（因而与学习记忆相关）、控制发育过程中大脑神经元回路的结构及突触可塑性、维持正常的兴奋性神经递质传递等重要生理功能[22]。

在药物损伤、噪声、缺血缺氧等病理状态下，细胞能量代谢障碍，ATP生成下降，导致神经细胞对谷氨酸摄取率下降，胞外谷氨酸大量积聚而使神经细胞处于高浓度的谷氨酸环境中，致NMDAR过度激活，Ca2+大量内流，胞内Ca2+浓度持续升高引起一系列生理病理反应，特别是激活磷脂酶C、磷脂酶A2、Ca2+激活神经元蛋白酶I和II、PKC、NO合酶、核酸内切酶等多种降解酶，破坏神经元的脂质膜、核酸、细胞骨架蛋白等重要成分，使神经元逐步溃变坏死。此外，Ca2+超载可触发自由基连锁反应，而大量的自由基又致使胞内的Ca2+进一步增加，如此恶性循环，最终使神经元变性乃至死亡，这便是NMDAR兴奋毒性的主要后果[23]。

2 NMDAR在听觉神经系统中的分布

现有研究表明NMDAR在中枢神经系统中大量分布，其中NR1广泛分布于各个脑区和脊髓。NR2分布具有明显的区域差异性，其中NR2A和NR2B主要分布于端脑和间脑，NR2C主要表达与小脑，NR2D主要表达于中脑与间脑。NR3A较为广泛地分布于中枢神经系统各区域，NR3B主要表达于运动神经元和脑干中[24]。

听觉动作电位的兴奋性活动起始自耳蜗内毛细胞（inner hair cell，IHC）突触的前后膜，经神经末梢传递到位于蜗轴的螺旋神经节神经元（spiral ganglion neuron，SGN），信号经蜗神经至蜗核-上橄榄核复合体-外侧丘系-下丘-内侧膝状体-听皮层这一通路产生听觉活动。NMDAR作为重要的兴奋性神经递质受体，在该通路的各级神经元均有不同程度表达。

2.1 IHC-SGN的突触

Nordang等[25]利用免疫组织学方法检测到谷氨酸与NR2B在人类耳蜗IHC与OHC（outer hair cell,外毛细胞）及SGN突起上均有分布。Niedzielski等[26]通过分子生物学技术检测发现，大鼠SGN上除有NR1外，NR2A-2D亦有大量表达。我们的研究也证实，大鼠SGN胞体与突起上有NR1、NR2A-D、NR3A-B等亚基的mRNA均有不同程度的表达，且表达除NR1外由高到低依次为：NR2B、NR3A、NR2D、NR3B、NR2A、NR2C[27]。在哺乳动物的IHC-SGN突触上，NMDAR的亚单位表达在个体的不同生长阶段各有不同。早期听觉发育阶段，主要是NR1与NR2A的表达；听觉发育成熟阶段，除NR1的表达显著下降外，NR2A几乎不再表达，而NR2B、NR2C、NR2D等亚基的表达水平相对升高，这与哺乳动物其他听觉核团的发育过程中NR2B表达下降、NR2A表达升高相反[19]。

2.2 蜗核（Cochlear nucleus,CN）

Bilak等[28]运用免疫细胞化学、原位杂交技术检测大鼠DCN（背侧蜗核）发现NR1高度表达于除颗粒细胞以外的CN神经元上。光学记录膜电位方法观察CN的神经电活动发现，谷氨酸受体NMDAR参与介导了CN神经元兴奋性突触后电位（excitato-ry postsynaptic currents,EPSCs）。且相比较于DCN中的EPSCs，NMDAR在VCN（腹侧蜗核）中介导的EPSCs更大[29]。

2.3 下丘（Inferior colliculus,IC）

Shim等[30]运用免疫组化法检测到，在SD大鼠IC上，NMDAR随着年龄的增长表达显著降低。RT-PCR法检测到水杨酸钠钠致耳鸣大鼠的IC中NR2B的mRNA明显升高[13]。大鼠IC中央核上可记录到NMDAR介导的迟发性EPSCs，且可被NMDAR特异性阻断剂APV（DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid,DL-2-氨基-5-膦酰基缬草酸）或CPP（(RS)-3-(2-carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1-phosphonic acid，（RS）-3（2-羧基哌嗪-4-基）丙基-1-膦酸）阻断[31]。Cong等[32]也证实了体外培养的大鼠IC神经元上有NMDAR电流存在。

2.4 内侧膝状体（medial geniculate body,MGB）

MGB分为背侧部分（MGBd）、腹侧部分（MGBv）和内侧部分（MGBm）。已知NMDAR在大鼠MGB上高度表达，且表达随着年龄的增长而升高。NMDAR在老年大鼠（出生后24月）的表达量显著高于幼年大鼠（出生后2周）[30]。同时，原位杂交法检测到：出生早期的大鼠MGB上，NR2A表达极低，而NR2B呈中度表达，但在两周后，二者表达均迅速升高，NR2A主要分布在MGBm，NR2B则在MGBv高度表达[33]。全细胞膜片钳记录法显示，NMDAR拮抗剂APV可显著抑制皮层中MGBd和MGBv神经元的EPSCs的持续时间及峰值，推测MGB中NMDAR诱发的EPSCs可能是MGB接受下丘的听觉纤维继而投射到听觉中枢这一过程的生理基础[34]。

2.5 听皮层（auditory cortex,AC）

NR1、NR2A、NR2B在AC上均有表达，且具有时间差异性。出生后35天以内的大鼠的AC中，NR1的表达量逐渐升高，且在出生后7、14天尤为显著，在听觉发育的关键期（出生后7-21天）予以单侧听觉剥夺时，NR1表达量明显降低[35]。原位杂交法也证实在大鼠AC中，NR2A在出生后早期的表达很低，在出生两周后急剧增加，但NR2B在出生后一直保持高水平[33]。此外，亦有发现NR2A主要存在于大鼠AC神经元的胞膜与胞浆内[36]。

2.6 其他听觉核团

研究已证实，上橄榄核复合体（SOC）和外侧丘系（LL）上亦检测到NR1、NR2A-D的表达，且NR1的表达明显高于NR2[37]。其中NR1在大鼠LL上的分布随着发育阶段而变化，于出生后前两周高表达，随后逐渐下降[38]。

3 NMDAR相关的听觉神经疾病

NMDAR被谷氨酸等兴奋性氨基酸激活后，介导一种缓慢而持久的兴奋性反应。NMDAR独特的亚基组成及发育规律有助于听觉信号的兴奋性传导，在听觉发育的关键期的突触可塑性过程中发挥重要作用。然而，NMDAR过度激活导致的兴奋毒性与水杨酸钠致耳鸣、噪声性听觉损伤、老年性聋、药物性耳聋等多种听觉神经疾病的发生发展密切相关。

3.1 水杨酸钠致耳鸣

水杨酸钠致耳鸣的机制复杂，假设众多，研究证实水杨酸钠可导致听觉传导通路中谷氨酸及NMDAR各亚基表达发生改变。

水杨酸钠作用于大鼠后，其耳鸣评分逐日增高，耳蜗、DCN、IC、AC和中脑上检测到NR2B的mRNA表达呈中度升高，AC上NR2A的mRNA亦明显增高，在停药后的14天，NR2B表达恢复正常，且耳鸣评分与耳蜗、IC中TNF-a,IL-1b和NR2B的表达水平呈正相关[13,39-42]。推测这些促炎因子表达的升高导致耳鸣可能是影响NMDAR功能所实现的。刘等[43]利用活体微透析技术发现，水杨酸钠致耳鸣大鼠模型的下丘中，谷氨酸水平明显升高。全细胞膜片钳记录显示，阿司匹林能显著增强大鼠SGN上NMDAR诱导的电流，且该电流可被NMDAR拮抗剂APV或Mg2+所阻断[44]。当单独使用环氧合酶（cyclooxygenase,COX）抑制剂Mefenamate时，亦可引起水杨酸钠致耳鸣类似的效应，推测水杨酸钠致耳鸣可能是通过抑制COX，进而阻碍花生四烯酸的代谢，花生四烯酸的积累又反过来增强NMDAR诱导的电流引起的[11]。表明NMDAR活性在水杨酸钠致耳鸣中具有重要作用。

水杨酸钠是诱导动物耳鸣模型的经典药物，水杨酸钠致耳鸣的机制涉及形态学、药理学、分子生物学、电生理等多个层面，但其确切机制尚无法阐释清楚。NMDAR相关的受体机制的研究是对水杨酸钠致耳鸣机制的重要补充，因此NMDAR在水杨酸钠致耳鸣中的研究具有十分重要的意义且亟待更进一步的研究。

3.2 噪声性听觉损伤

噪声按时间变化的属性分为脉冲噪声与稳态噪声，二者引起听觉损伤的机制不同。脉冲噪声损伤对听器主要是机械性损伤，如毛细胞损伤、前庭膜破裂、网状膜破裂、corti器从基底膜上剥离。而稳态噪声损伤对听器主要是代谢性损伤。如内耳过量自由基产生、内耳局部缺血、谷氨酸兴奋毒性、神经营养因子缺乏等。脉冲噪声一般在机械性损伤之后亦继发代谢性损伤。耳蜗微循环障碍为两种不同类型噪声性听觉损伤后期的共同通路。在代谢性损伤中，谷氨酸兴奋毒性正受到越来越多的关注。噪声刺激下，IHC上谷氨酸大量释放除了过度激活AMPAR或KAR，导致与IHC相连的I型SGN传入树突急性破坏，还会过度激活NMDAR，引起Ca2+大量内流，触发自由基产生、蛋白酶、核酸内切酶的激活等级联代谢性事件，最终致SGN的死亡[45]。

Dong等[46]研究发现在大鼠噪声暴露的急性损伤期，同侧及对侧CN、IC的NR1的mRNA表达均降低，但2周和4周时其NR1的mRNA表达均升高，提示CN和IC的NMDAR参与了噪声性耳聋的后期发生发展过程。Wang等[47]观察到，噪声暴露2小时后的大鼠AC的NR2A蛋白表达量明显升高，但噪声暴露3小时后的72小时，NR2A蛋白表达量不再改变，而NR1、NR2B蛋白表达量始终无明显变化。此外，大鼠噪声下分别暴露24小时、3天、10天后，听性脑干反应的反应域上移，SGN上NR1的mRNA表达量逐渐升高，而AC和IC上NR1的mRNA表达量则逐渐降低[48]。Brozoski等[49]报道，噪声诱导的耳鸣大鼠的CN的电活动明显增强，NMDAR拮抗剂D-APV能抑制这种效应，推测NMDA介导的谷氨酸能的递质传递及CN电活动的增强与噪声诱导的耳鸣相关。

噪声性听觉损伤是机械性损伤与代谢型损伤综合作用的结果，其中代谢型损伤中的谷氨酸兴奋毒性在噪声性听觉损伤发生发展过程中的作用至关重要。因此，谷氨酸受体NMDAR的相关研究不仅在噪声性听觉损伤中的发病机制中具有重大意义，而且对于开发预防噪声性听觉损伤的药物上具有极大的研究价值。

3.3 老年性聋

免疫组化法显示老年大鼠听皮层的谷氨酸含量明显升高，推测过量谷氨酸聚集在突触后膜与谷氨酸受体相结合，导致膜内外某些离子（如Cl-和Ca2+）失衡，线粒体不可逆损伤，氧自由基大量产生，继而引起听觉神经元受损乃至死亡[50]。

通过对比老年大鼠（出生后24月）与年幼大鼠（出生后2周）听觉系统中NMDAR中的表达变化，发现相比较于年幼大鼠，老年大鼠的CN、MGB、AC上的NMDAR表达量明显升高，而在SOC和IC上表达降低[30]，SOC和IC上NMDAR表达量下降可能的原因是为缓解NMDAR兴奋毒性导致的保护性受体表达量下降，是机体避免兴奋毒性进一步发生的保护性反射。我们研究也发现大鼠SGN上NR1的mRNA和蛋白的表达随着大鼠年龄的增长而升高，推测SGN上NR1表达升高改变了耳蜗的突触传递，是外周听觉系统在耳蜗神经细胞老化功能衰退后维持声信号传入兴奋性的一种代偿机制[18]。而Peng等[51]认为，老年性聋大鼠SGN上NR1的表达上调可能是通过恢复相关突触连接代偿老年大鼠SGN的变性死亡。

老年性聋的发生发展可能是个体因素与环境因素共同作用的结果。随着年龄增长，不同听觉核团NMDAR的表达发生显著改变，且变化趋势不完全一致，这可能与NMDAR在不同部位所起作用不同有关，具体的机制仍需大样本不同年龄段动物的不同听觉核团重NMDAR表达的进一步研究。

3.4 药物性耳聋

目前已知的耳毒性药物有近百余种，常见的有氨基糖苷类抗生素、抗疟药、抗肿瘤制剂、水杨酸盐类止痛药、利尿剂等。不同药物的损伤靶点及机制不同，如直接损伤毛细胞的膜性结构，破坏膜通透性，破坏线粒体结构，破坏内耳血管纹造成内外淋巴液生化成分改变等，但是并没有深入到分子和受体水平的研究。Bieńkowski[52]发现，氨基糖苷类抗生素可通过与NMDAR多胺调节位点相互作用增强NMDAR的功能引起大鼠耳聋，且NMDAR拮抗剂艾芬地尔（ifenprodil）及MK-801可减弱氨基糖苷类抗生素的致聋作用。推测大剂量的氨基糖苷类抗生素可通过NMDAR离子通道介导Ca2+大量内流，促进毛细胞与耳蜗神经纤维的变性死亡，继而引起耳聋[52]。

药物性耳聋的致病机制因药物不同而异，目前的研究显示，只有氨基糖苷类药物致耳聋的致病机制的研究深入到受体水平，更多与NMDAR相关的药物性耳聋的研究仍是有必要的。

4 小结与展望

NMDAR广泛分布于听觉神经系统，具有重要的生理作用，也与水杨酸钠致耳鸣、噪声性听觉损伤、老年性聋、药物性耳聋等听觉神经疾病密切相关，拮抗NMDAR的药物研究具有重要意义，但大部分药物因难以克服的副反应限制了其在临床上的应用。NMDAR结构复杂，作用位点众多，决定了NMDAR功能受多种因素的影响，既能减轻NMDAR介导的兴奋毒性，又不干扰NMDAR的正常生理功能的药物的研制将是今后的主要研究方向。