SLC26A4基因突变致前庭水管扩大听力损失机制的研究进展

薛文悦 陈正侬

上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科

前庭水管扩大（Enlarged Vestibular Aqueduct,EVA），又称为扩张型或大前庭水管（Dilated Vestibular Aqueduct,DVA或Large Vestibular Aqueduct,LVA），是一种常染色体隐性遗传病，也是感音神经性聋儿童的一种常见内耳畸形。EVA患者听力下降具有延迟发作和进行性发展的特点。这一病程发展特点为预防或延缓EVA患者听力损失提供了时间窗。明确EVA听力损失的发生机制可以帮助我们有针对性地对EVA患者进行早期干预和拟定治疗方案，尽可能保护患者的听力及语言功能。

1 EVA的临床表型

1.1 EVA的临床症状

EVA通常是一种非综合征型耳聋，其主要临床表现为听力损失[1]。EVA患者的听力损失主要为感音神经性聋，不同患者间耳聋严重程度不等，同一患者双耳可出现单侧耳聋或两侧听力损失程度不同，其发生时间可在语前或伴随儿童语言发育的进展。在一段时间内，EVA患者的听力保持波动状态，并呈整体下降的趋势，也有一部分患者在很轻的头部撞击或气压伤后表现为突发性耳聋[2]。在一些遗传综合征患者中也可以发生EVA，包括伴有耳聋的远端肾小管酸中毒综合征，CHARGE综合征，Waardenburg综合征和鳃-肾-肾综合征，其中最常见是Pendred综合征。

除了听力下降以外，部分EVA患者还伴有前庭症状。在Zalewski等人对106例平均年龄12岁的EVA患者前庭功能研究中，45%的患者存在前庭症状与体征，包括旋转性眩晕史、行为笨拙、语前头部倾斜及呕吐史和独立行走延迟，但并不是所有具有前庭症状与体征的患者都存在前庭检查结果异常[3]。

1.2 EVA的影像学表现

计算机断层扫描（CT）是前庭水管等骨性结构进行成像的最佳影像学方法。EVA的现代影像学诊断标准为：倒“J”形前庭导水管中点直径＞1.5mm或总体形态严重畸形[4]。而正常的前庭水管通常非常狭窄，在CT图像中几乎不可见。磁共振（MR）成像可以观察前庭水管的软组织和液体内容情况：内淋巴囊和淋巴管均扩大[5]。

1.3 基于EVA临床表型的致病机制假设

根据EVA相关的听力损失具有其独特听力表型，人们提出了许多假设。较早的假设认为头部创伤或气压伤引起颅内压升高，内淋巴囊和导管的内容物逆流入中阶，损伤毛细胞，导致听力下降[2]。然而，无论是内淋巴囊切除术还是内淋巴囊减压术均不能改善患者听力，甚至加重了患者听力损失程度[6]，说明该假设不成立。

另一种假设是基于同样内淋巴结构扩大的内淋巴积水模型，其波动性听力损失与EVA听力变化存在表型相似性。假设认为内淋巴积水增加了内淋巴渗透压，造成耳蜗Reissner氏膜破裂，外淋巴渗入内淋巴，引起内淋巴成分改变以及毛细胞受损，出现听力下降的表现。但这一假设也被否定了，研究显示内淋巴积水只是细胞或分子病变的非特异性表现，并不是引起听力损失的直接原因[7]。

2 EVA致病基因及其功能

2.1 EVA的突变基因

1996年，Griffith等发现前庭水管扩大具有家族聚集倾向[8]。1999年，Abe和Usami等的研究表明前庭水管扩大是一种常染色体隐性遗传性疾病，其发生与位于7q31的SLC26A4（Gene ID:5172）基因突变有关[9]。一项大规模研究显示由SLC26A4基因突变引起的儿童耳聋约占全球耳聋人口的5%-10%。已报道的EVA耳聋患者SLC26A4基因的突变率和热点突变存在着明显的地域和种族差异。在欧美多中心研究中，1∕4的EVA患者可检测到SLC26A4双等位基因突变，另1∕4患者群体存在单等位基因突变，余下的一半患者未检测到突变[10]。中国人群大前庭水管患者SLC26A4基因的研究显示，92.1%的EVA患者存在基因的突变[11]。在对中国华东地区135例非综合征性EVA耳聋先证者SLC26A4基因筛查，74.07%（100∕135）的患者携带有SLC26A4双等位基因突变，7.41%的（10∕135）的患者携带SLC26A4单等位基因突变，而18.52%（25∕135）的患者未检测到任何SLC26A4基因突变，热点突变方式为c.919-2A＞G和p.H723R[12]。通过基因检测结果与听力检查分析可以发现，与单等位基因突变及无基因突变EVA患者相比，双等位基因患者双侧EVA发生率更高，但听力损失程度则并不统一。

2.2 SLC26A4表达产物及其功能

SLC26A4基因含21个外显子，开放阅读框架2343bp，编码由780个氨基酸构成的蛋白质，称为pendrin[13]。Pendrin蛋白是一种跨膜阴离子转运蛋白，存在12个及以上跨膜结构域，在上皮细胞的顶端膜上交换各种阴离子（Cl-和I-）和碱性基团（如OH-和HCO3-）[13]，除了在内耳、甲状腺分布外，在肾脏、乳腺[14]、子宫[15]、睾丸、胎盘[16]中均有分布。Wangemann等人的研究显示在小鼠内耳，pendrin分布于耳蜗侧壁外侧螺旋沟的上皮细胞、螺旋凸的表面上皮细胞、血管纹的梭形细胞顶端膜、前庭迷路的过渡细胞和内淋巴囊的富线粒体细胞中[16]，是Cl-∕HCO3-转运体[17]。

Pendrin蛋白在建立听力的过程中发挥重要作用。已知Foxi1基因仅对Slc26a4（Gene ID:23985）在内淋巴囊和淋巴管的表达进行调控。研究发现Foxi1敲除小鼠存在听力下降，由此推断内淋巴囊上pendrin表达对于听力正常很重要[18]。Nishio等人还发现若在Slc26a4基因敲除（Slc26a4-∕-）小鼠内耳蜗电位成熟前（出生后第6天）再次诱导pendrin表达，小鼠早期听力的波动情况将得到改善，这提示了pendrin对出生后听力保持稳定有着非常重要的作用[19]。

2.3 用于EVA发病机制研究的动物模型

三种小鼠模型曾经用于EVA发病机制研究，包括Slc26a4敲除小鼠（Slc26a4-∕-）[20,21]、Slc26a4敲入小 鼠（Slc26a4tm1Dontuh∕tm1Dontuh）[22]和 ENU 转 基 因 小 鼠（Slc26a4loop∕loop）[23]，三种小鼠模型均能使小鼠内耳pendrin表达不足，前庭水管扩大，最终造成听力不同程度下降。目前对于EVA听损机制的研究主要通过Slc26a4敲除小鼠进行，这类小鼠的Slc26a4基因外显子8缺失[21]，形成pendrin截短蛋白，无法发挥其正常的生理功能，最终出现EVA的病理变化。然而Slc26a4-∕-小鼠模型虽能反映Slc26a4基因突变的内耳变化，但其听力损失的程度较严重、发展速度较快与人类临床听力表型不相符。现已知Slc26a4在E16.5到P2的表达对于小鼠出生1个月内形成正常听力十分必要。Choi等人开发出一种tet-on系统模型。在这个模型中，将非基因关联的效应子和反应子转入Slc26a4-∕-小鼠（Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-），通过多西环素诱导来调控 pendrin蛋白表达的时间[24]，使得小鼠听力更好地模拟EVA相关听力损失的听力表型。近几年，这个基于tet-on系统的新模型已开始逐步运用到EVA相关听力损失的机制研究中。

3 EVA内耳的发育及听力损失机制

EVA的病理变化始于内耳胚胎发育期。内耳由外胚层内陷分化而来，形成原始听泡。在胚胎期（E）第9.5天时小鼠开始形成听泡，此时听泡充满羊水，其成分与血浆类似。发育中的上皮细胞进行内容物成分转换的时间与方式目前尚不清楚[1]。在约E10.5时听泡发出两处突起，一处逐渐形成耳蜗结构，另一突起则构成了内淋巴囊，沿蜗轴走行的前庭迷路也在此时形成。在E14.5小鼠耳蜗管腔形成[25]。

在E11.5时，正常小鼠内淋巴囊中首先出现pendrin表达，并且其表达量在E14.5迅速上升。当E14.5时，即Slc26a4-∕-小鼠内淋巴囊不能正常表达pendrin后的第3天，小鼠内耳出现第一个病理变化：内淋巴囊和耳蜗管扩大[18]。此时Slc26a4-∕-小鼠耳蜗横截面积明显扩大，相当于正常大小的10倍。小鼠内淋巴囊和耳蜗管的形成是前庭迷路液体分泌和内淋巴囊液体吸收的共同作用。为了研究Slc26a4-∕-小鼠前庭水管扩大究竟是前庭分泌功能亢进引起还是内淋巴囊吸收障碍导致，Kim等人分别对胚胎期耳蜗进行前庭迷路和内淋巴囊结扎。实验结果显示pendrin蛋白缺乏的Slc26a4-∕-小鼠蜗管扩大程度与内淋巴囊结扎所引起的蜗管扩大相类似[25]，提示内淋巴的吸收障碍是前庭水管扩大的主要原因。而前庭迷路的液体分泌功能仅在胚胎期帮助耳蜗管腔形成，pendrin蛋白对胚胎期前庭迷路液体分泌功能几乎没有影响[25]。内淋巴囊上皮主要由富含核糖体的细胞组成，其被富含线粒体的细胞穿插。富线粒体细胞顶端膜上存在着质子泵和转运Cl-∕HCO3-的pendrin蛋白。富核糖体细胞表达Na+通道，由H+-ATP酶产生的电流驱动Na+通过Na+通道重吸收。Pendrin蛋白主要将质子泵产H+时分解出的HCO3-排出，而pendrin蛋白缺失会引起富线粒体细胞内HCO3-浓度上升，H+生成受阻，继而使得Na+重吸收的驱动力降低，影响Na+转运，内淋巴液中Na+浓度增加，导致内淋巴囊液体吸收功能障碍[25]。最终内淋巴体系容量增大，耳蜗管腔随之增大。

在E13.5-16.5时pendrin逐渐在耳蜗、球囊和椭圆囊上表达。耳蜗pendrin无表达后的1-2天，即约E15.5时，Slc26a4-∕-小鼠出现第二个病理变化：耳蜗内淋巴液发生酸化[18]。内淋巴囊酸化出现稍晚，约E17.5时出现，提示内淋巴对于腔内液体具有较强的缓冲能力。内淋巴液的pH主要取决于HCO3-与H+分泌以及碳酸酐酶活性。血管纹边缘细胞是耳蜗中CO2最主要的来源[26]。血管纹是一种高代谢组织，其呼吸商为1.2，即每消耗1摩尔氧气将释放1.2摩尔的CO2[17]。正常情况下，血管纹产生的大量CO2会被螺旋凸分泌的碳酸酐酶分解为H+和HCO3-。另外，螺旋韧带的纤维细胞通过Na+-HCO3-协同转运蛋白Slc4a7吸收HCO3-并通过缝隙连接向周围细胞转运。正常情况下，Cl-∕HCO3-转运体pendrin蛋白介导血管纹中HCO3-分泌，使内淋巴中的HCO3-浓度较外淋巴液高，内淋巴液呈碱性。反之，当pendrin蛋白缺乏时，血管纹不能有效地转运HCO3-，内淋巴液出现酸化[17]。

由于内淋巴液酸化，内淋巴Ca2+转运也会继发受到影响。生理条件下，内淋巴中的Ca2+浓度为20-30 mol∕L，远低于细胞外液中的Ca2+浓度。内淋巴Ca2+浓度过高或过低均会抑制换能电流和微音电位，影响听觉换能。当内淋巴酸化时，酸敏感Ca2+通道Trpv5和Trpv6的重吸收功能会被抑制，造成内淋巴液内Ca2+浓度上升。生理情况下，通过换能通道进入毛细胞束的大部分Ca2+会通过Ca2+-ATP酶排出[27]。毛细胞上Ca2+-ATP酶的转运功能有限，一旦Ca2+过量流入感觉细胞就会导致细胞中 Ca2+超载。毛细胞 Ca2+超载可能是Slc26a4-∕-小鼠出生后（P）7-15天外毛细胞变性的原因。听觉细胞变性将使得Slc26a4-∕-小鼠，甚至EVA患者，失去了重建听力的机会[17]。

小鼠刚出生时听觉尚未形成，P10开始小鼠内耳逐渐形成稳定的内耳蜗电位（EP），在P12时开始建立听力。Wangemann等人对新生尚未建立听力的Slc26a4-∕-小鼠进行检测发现，在 P10Slc26a4-∕-小鼠内淋巴中可检测微弱的EP,但随着小鼠进一步成长发育，EP逐渐消失，这与小鼠血管纹Kcnj10的表达情况相一致[17]。内耳蜗电位由血管纹产生，是听觉换能的主要驱动力[26]。EP本质上是K+的平衡电位，通过血管纹中间细胞顶端膜上K+通道Kcnj10的内向整流作用建立[28]。对成年Slc26a4-∕-小鼠进行检测可以发现其血管纹缺乏Kcnj10蛋白表达，不能建立正常的EP且听力丧失[16]，提示由K+通道Kcnj10蛋白表达下降所引起的EP异常是EVA患者听力下降的直接原因。

从血管纹的结构入手我们可以发现，当前庭水管扩大时，上皮细胞间以及上皮细胞和间充质细胞间的距离延长、疏松，细胞间的信息通讯将受到影响。细胞间通讯在耳蜗Corti氏器发育过程中起着重要的作用，Slc26a4-∕-小鼠血管纹发育延迟可能也与此有关[29]。前庭水管扩大可能导致细胞间缝隙连接受损，进而引起细胞信息传递异常可能是Slc26a4-∕-小鼠听力障碍的另一个原因[25]。

Nishio等人采用tet-on系统模型尝试在母鼠受孕至E17.5及P6之后两阶段诱导pendrin蛋白表达发现，Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-小鼠出生后 1 个月是仍保有较稳定的EP及较好的听力[19]，提示pendrin蛋白在小鼠出生后听力维持中起着重要作用。在小鼠内耳血管纹中，pendrin蛋白与Kcnj10蛋白分布在不同的细胞中，pendrin主要分布在螺旋突起及螺旋外沟的上皮细胞中，而Kcnj10仅分布于血管纹中间细胞顶端膜，所以pendrin蛋白表达缺失并不是Kcnj10蛋白损失的直接原因。在对Slc26a4-∕-小鼠和从交配期到E16.5诱导pendrin表达的Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-小鼠的观察中我们可以发现虽然二者出生时听力程度不同，但在它们的血管纹冰冻切片中均存在中间细胞的色素沉着较正常小鼠的数量多、颗粒大[16,30]，这提示了小鼠血管纹中间细胞存在着氧化应激反应。Slc26a4-∕-小鼠的内耳蛋白检测发现小鼠血管纹中氧化蛋白及硝化蛋白含量明显上升，而其抗氧化的防御机制则相对减弱[31]，则进一步佐证了Slc26a4-/-小鼠内耳血管纹氧化应激反应的存在。

在听力形成前（P10），Slc26a4-∕-小鼠内耳即开始产生自由基应激。Slc26a4-∕-小鼠因pendrin蛋白缺乏而引起前庭水管扩大和内淋巴液酸化都可以促使氧化应激发生。在扩大的前庭水管中，为了维持内淋巴液正常的离子浓度，血管纹上Na+、K+等离子通道的转运速率增快，代谢活动增多。酸化的内淋巴液活化酸激活Kcnq1通道，进一步增加血管纹代谢活动[1]，生成大量自由基。当自由基产生过多，超过内耳的抗氧化防御机制后，自由基敏感的Kcnj10蛋白就会遭到损坏[31]，Kcnj10蛋白表达量下降，从而影响EP稳态，听力出现下降。

4 EVA患者听力波动性下降的机制探讨

如果用Slc26a4-∕-小鼠的观察结果来解释EVA患者波动性听力损失的病因，我们可以确认EVA患者听力波动是由于内耳蜗电位敏感地随内耳氧化应激反应变化[30]。内耳蜗电位和氧化应激组成一个负反馈系统，引起听觉所需的内耳蜗电位波动变化。这一负反馈假设由三个元素组成。其一，分泌K+时血管纹边缘细胞产生的代谢副产物活性氧（ROS），其二是向边缘细胞提供K+以产生内耳蜗电位的ROS敏感钾离子通道KCNJ10；其三是K+诱导的K+分泌[1]。ROS敏感的KCNJ10在ROS作用下表达减少，正常内耳蜗电位和听力受到破坏。同时K+流减少，边缘细胞K+分泌功能受到限制，其代谢和ROS产生的速率降低。而ROS产量的降低又使得KCNJ10表达得到部分恢复，耳蜗内耳电位及听觉也随之恢复。但此时流向边缘细胞的K+流再次增加，又会刺激血管纹边缘细胞K+分泌，代谢增加和ROS生成增多，KCNJ10蛋白再次受到损伤，在反复这一循环的过程中，KCNJ10的表达不能得到完全的恢复，总体呈减少的趋势，直至最终无法形成听力所需的EP，患者最终听力丧失。而当内淋巴Ca2+浓度升高并且毛细胞Ca2+超载时则会对患者导致不可逆的听力损失[17]。

5 总结与展望

前庭水管扩大是儿童感音神经性耳聋中相对常见的病因，但目前我们对EVA引起听力下降的机制了解还不够透彻。EVA患者听力损失的延迟发作和进行性发展特点，为临床进行干预以防止或减缓听力损失进展提供了治疗时间窗，尤其对于处于语音习得阶段的婴幼儿来说至关重要。小鼠模型的研究表明，内耳耳蜗管与内淋巴囊增大、内淋巴液酸化是听力丧失发病机制中的早期事件。接下来，我们研究听力损失的机制应集中在耳蜗发育过程中液体运输和耳蜗外侧壁细胞和分子功能改变。这些研究的结果可能会指导制定相应的治疗方案，以最大限度地保留SLC26A4突变患者的听力。