听觉毛细胞发育再生研究进展

易英 郝香月 涂钰莹 龙孝斌

感音神经性听力下降可以由听觉传导通路中的耳蜗、听神经、脑干听觉通路和听觉中枢病变引起，其中耳蜗毛细胞极其脆弱，易受药源性、病原性以及噪声暴露等诸多因素损伤。现已有斑马鱼、鸟类和哺乳动物等多种脊椎动物模型被用于听觉系统、造血系统、心血管系统和神经系统的研究[1]，斑马鱼因体型小、繁殖周期短、幼鱼透明、产卵量大、与人类基因同源性高，被广泛用于构建人类疾病模型和大规模的化学药物和遗传筛选[2, 3]。大量关于斑马鱼毛细胞再生的研究为哺乳动物毛细胞再生提供了潜在的靶点；因哺乳动物内耳毛细胞不能自发再生，目前研究主要围绕着体外诱导前体细胞和干细胞分化为毛细胞。了解调控毛细胞发育的信号通路是毛细胞再生研究的另一方向；在斑马鱼、小鼠或禽类动物毛细胞发育及再生过程中，Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路、Sonic hedgehog(Shh)信号通路、FGF信号通路等都起着关键作用，不同通路之间相互联系、相互作用，共同组成调节毛细胞发育再生的信号网络。本文从Wnt/β-catenin信号通路、Shh信号通路、Notch信号通路入手，综述其在听觉毛细胞再生过程中的研究进展，以初步了解多信号通路在毛细胞发育中的相互联系。

1 毛细胞再生的发现

1987年，Cotanche在研究氨基糖苷类药物诱导雏鸡毛细胞死亡的过程中，偶然发现雏鸡基底乳头中感觉上皮再生的现象，打破了之前人们对脊椎动物毛细胞在有丝分裂后听觉感觉上皮细胞受损后基本不能再生的认知[4]。1988年，Cotanche利用噪声诱导雏鸡毛细胞死亡后亦发现毛细胞再生的情况[5]，而后2003年Harris首次以新霉素处理致斑马鱼毛细胞损伤后，发现在一定浓度范围内再生情况呈剂量反应相关性[6]。尽管鼠类基因与人类基因有99%的相似性，更适合用于研究哺乳动物毛细胞再生机制，但其繁殖周期长、成本高等缺点限制了小鼠模型的发展。近年来学者们对于体外诱导哺乳动物听觉毛细胞再生的研究逐步深入，最初，Kawamoto等[7]利用腺病毒载体转染Math1基因至豚鼠的耳蜗，在Cozti器、内沟细胞、Hensen细胞区域都发现了不成熟的毛细胞；随后，编码Atoh1的腺病毒转染耳蜗感觉上皮并原位诱导毛细胞形成，Notch抑制剂DAPT和Atoh1的联合应用增加了Atoh1表达水平并降低了hes1和hes5水平，进一步促进了体外毛细胞的产生[8]。小鼠体内研究发现新生小鼠毛细胞在注射白喉毒素诱导损伤后，支持细胞保持着有限的瞬时再生能力[9, 10]。

2 毛细胞再生的来源

在成年哺乳动物及人类内耳中，极少数前庭毛细胞可自发再生，而目前研究显示耳蜗毛细胞损伤后是无法自发再生的[11]。与成熟哺乳动物耳蜗不同，新生的小鼠耳蜗毛细胞在损伤后具有短暂的自发再生能力[10]；而鸟类、斑马鱼和两栖动物的相关研究已发现再生毛细胞来源。

2.1非哺乳动物毛细胞再生来源 雏鸡支持细胞通过两种不同的机制产生新的毛细胞：①支持细胞有丝分裂分化再生;②支持细胞的直接转分化，即一种细胞改变其表型而获得另一种分化状态，但这一过程不进入细胞周期[12]。斑马鱼作为另一种非哺乳动物模型，其侧线神经丘毛细胞与内耳毛细胞同源，影响侧线神经丘毛细胞功能的突变也会导致人类耳聋。侧线神经丘是由处在中央区的感觉毛细胞、位于毛细胞下方的支持细胞和环形包绕神经丘的盖细胞共同组成的。Romero-Carvajal通过70小时延时记录跟踪侧线毛细胞谱系，发现在新霉素处理后，支持细胞的转分化是侧线毛细胞再生的主要途径，其次少数支持细胞通过有丝分裂增殖分化为毛细胞，极少数情况下药物严重损伤神经丘导致支持细胞耗竭，盖细胞才能进入细胞周期转分化为毛细胞[13]。

2.2哺乳动物毛细胞再生的可能来源 毛细胞极易受到感染、噪声和药物(如：铂类[14,15]、氨基糖苷类药物、铜)等因素的损害[4]。目前体外研究中哺乳动物毛细胞再生的可能来源如下：①前体细胞(存在于耳蜗内，在分化阶段上处于毛细胞上游，并能够进一步分化成毛细胞的细胞):Wnt信号通路的靶基因Lgr5标记的耳蜗支持细胞在体外和体内均表现为感觉前体细胞，而这些细胞具有再生毛细胞的内在能力[16]。②支持细胞：新生小鼠支持细胞保持着有限的瞬时再生能力，且能够下调细胞周期抑制剂，重新进入细胞周期并在体外培养中产生毛细胞[9]。White等[17]从新生小鼠耳蜗中分离的支持细胞可在体外增殖，并具有转分化为毛细胞的潜能，但这种增殖能力在小鼠出生后的第2周停止。③小上皮嵴细胞：Zhai等[18]从大鼠小上皮嵴分离得到前体细胞,当诱导表达Hathl基因时，这些前体细胞表现出毛细胞样细胞的特征，将这些细胞与间充质细胞共培养能产生具有毛细胞特异标记的细胞。④干细胞：干细胞因强大的自我更新能力和多向分化潜能等优点，为哺乳动物毛细胞再生提供了一个更具前景的方向。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)、内耳干细胞(inner stem cell,IESC)以及外源性成体干细胞(嗅觉上皮细胞、毛囊干细胞、间充质干细胞等)都具有分化为毛细胞的潜能[19]。虽然众多研究显示干细胞能在体外诱导分化为毛细胞，但移植的方式、移植细胞的分化阶段、新生毛细胞的功能和特性以及移植后的稳定性、安全性等都还需要进一步的研究，而其中最为关键是需要恰当地调控再生毛细胞的数量及其定位，以期发挥毛细胞正常功能。

3 毛细胞再生关键调控因子及相关途径

目前研究显示毛细胞再生是多靶点多基因调控的过程，其中以Wnt/β-catenin信号通路和Notch信号通路的研究最为深入；此外还有Shh信号通路、FGF信号通路、JAK-STAT等，各个通路之间有联系亦有区别[20, 21]。相关的调控因子也有很多，如：Shh、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转录激活因子3(stat3)、维甲酸(retinoic acid,RA)、组蛋白H3K9二甲基化( dimethylation of lysine 9 on histone H3,H3K9me2)、microRNA 183家族[22～26]等。

3.1Wnt/β-catenin信号通路 Wnt信号通路在细胞发育、生长和再生过程中起重要作用，目前可以分为以下三类，经典Wnt/β-catenin 信号通路、Wnt/PCP信号通路以及Wnt/calcium信号通路，其中经典Wnt/β-catenin 信号通路研究较为成熟。Wnt是一组富含半胱氨酸的分泌性蛋白,广泛存在于各种动物及各种组织中。由于Wnt信号与受体Frzzled结合，引发低密度脂蛋白相关受体蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)被糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3)和其他激酶磷酸化，从而使Axin与LRP结合，致使Axin/APC/GSK3/β-catenin复合物解离，避免β-catenin被GSK3磷酸化从而转位至细胞核内与TCF结合，激活靶基因转录[27]。

研究报道Wnt/β-catenin不仅在斑马鱼后侧线细胞迁移起重要作用[28]，并且参与哺乳动物内耳早期的听基板及听泡的分化[29]。Head等[30]研究发现斑马鱼神经丘在稳态或氨基糖苷类损伤后，GSK3β抑制剂(1-azakenpaullone)刺激Wnt信号通路引起支持细胞增殖显著增加；另一方面过表达dkk1b抑制Wnt信号传导可抑制毛细胞发育和再生过程。此外，Wnt信号可与dkk2形成负调控循环，维持神经丘形态及大小[31]；而在电离辐射处理后的斑马鱼可通过释放dkk2抑制Wnt信号通路，同时抑制支持细胞的活性导致毛细胞再生障碍[32]；这些研究表明，Wnt信号通路对调控毛细胞发育、生长和再生过程中支持细胞增殖起重要作用。Jiang等[33]在新霉素导致斑马鱼毛细胞死亡后1、3和5 h对神经丘进行表达分析，发现Notch和Fgf信号在再生的最初几个小时内被下调，而Wnt信号在再生的前10个小时内没有被激活，说明Wnt没有参与触发毛细胞增殖的初始阶段。总而言之，虽然Wnt通路明显影响再生毛细胞的数量，但却不触发再生。

尽管许多研究已经明确了经典Wnt信号通路在哺乳动物耳蜗毛细胞发育过程中的作用，但其在哺乳动物毛细胞再生中的具体作用有待进一步研究。Li等[34]发现抑制Notch信号通路可诱导新生小鼠耳蜗支持细胞中β-catenin的过表达和Wnt下游靶基因的激活，表现为Lgr5+支持细胞增殖并促使它们向毛细胞转分化。富含亮氨酸G蛋白偶联受体5(leucinerich repeat-contianing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)是近年来发现的Wnt信号通路的靶基因，是G蛋白偶联受体家族中的成员之一。Lgr5+支持细胞在体内和体外通常都处于静止状态，但当它们分离为单个细胞时将具有增殖和转化为毛细胞样细胞的能力。Shh信号传导的激活亦促进Lgr5+祖细胞的增殖和随后的毛细胞分化[21]。此外，Lgr5+支持细胞过表达β-catenin和Atoh1，可增加Lgr5+支持细胞增殖分化为毛细胞，但新生的毛细胞仍为不完全成熟的毛细胞[35]，却为研究哺乳动物毛细胞再生提供了可行的新方向。最近一项研究[36]发现Wnt和Notch信号通路在Lgr5+祖细胞和Lgr6+祖细胞中基因表达水平相似，与Lgr5+祖细胞相比，Lgr6+祖细胞具有更强大的分化为毛细胞的能力，而Lgr5+祖细胞比Lgr6+祖细胞具有更强的增殖能力。

3.2Shh信号通路 Shh是Hedgehog(Hh)基因家族中的一类，也是目前研究广泛的信号通路之一。Shh信号通路在胚胎发育过程中参与调控多个器官及组织的生长发育。分泌性配体Shh结合其受体Ptch，减弱了Ptch对Smo的抑制作用，Smo膜蛋白去阻遏，激活Gli转录因子,触发胞内信号转导机制，启动下游靶基因转录[37]。

研究发现Shh信号与内耳结构的形态发育关系十分密切[21],特别在背腹轴(dorsoventral axis，D-V 轴)的形成中起到关键性作用。Shh信号通路转录因子Gli3R和Gli2/3A之间的平衡调控着哺乳动物内耳D-V 轴的长度[38]。Shh浓度影响着内耳原基的发育分化方向，内耳原基中Shh浓度高的部位发育成腹侧的听觉器官，Shh浓度低的部分发育成前庭器官。亦有研究发现,Shh通过调节cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的浓度，从而抑制Gli3活性，影响小鼠内耳发育中的腹侧极性[39]；在没有新霉素处理的情况下，Shh信号通路上调并没有显著促进细胞增殖或新的毛细胞形成，然而，在新霉素损伤感觉上皮后，过度激活Shh信号导致新生小鼠耳蜗上皮外植体中支持细胞增殖和毛细胞再生,并提出Fgf、Wnt、Notch和Hedgehog信号通路之间复杂的相互作用促进毛细胞再生，Mfng基因可能是Hedgehog信号通路的下游靶标，并可能作为耳蜗感觉上皮细胞中Hedgehog和Notch信号通路之间的介质[21]。虽然现已有很多研究分析了Shh作用于耳蜗发育期间的信号传导，但其在毛细胞再生过程中的作用有待进一步研究。

3.3Notch信号通路 Notch信号通路是一种进化上保守的通路，可以抑制各种组织中的细胞模式：如增殖、分化和凋亡。哺乳动物具有4种不同类型的Notch受体(Notch 1～4)和5种Notch配体(Jagged 1、Jagged 2和Deltal、Delta3、Delta4 )，Notch受体由胞外区(N-terminal extracellular do main，NEC)、跨膜区(transmembrane domain，TM) 和胞内区((Notch intracellular domain，NICD)3部分组成。当相邻细胞表面的Delta或Jagged配体与Notch受体结合后，Notch受体蛋白水解，释放NICD，然后转位到细胞核中与DNA结合蛋白CSL结合并形成活性转录复合物，随后MAML转录激活蛋白家族与该复合物结合，从而诱导了Notch靶向基因的转录[40]。

在小鼠内耳发育过程中，Notch信号通路使胚胎前体感觉细胞定向分化成毛细胞，同时形成支持细胞，亦通过侧抑制发挥作用，使新生的毛细胞中抑制Atohl和其他促进毛细胞分化的基因表达。Atoh1在耳蜗上皮细胞中过度表达可诱导新的毛细胞形成，腺病毒介导的Atoh1过度表达主要使用在大鼠小上皮嵴并诱导异位毛细胞再生，但转导率低[8]。但Notch抑制剂DAPT和Atoh1的联合应用增加了Atoh1表达水平并降低了hes1和hes5水平，促进体外大鼠耳蜗感觉上皮细胞毛细胞再生[8]。Walters等[20]提出GATA3或POU4F3和ATOH1的共活化促进成年小鼠中SCs向HC的转化，遗憾的是，虽然GATA3或POU4F3的异位表达能够克服Atoh1介导的SC转化的年龄限制，但转化的细胞仍然不成熟。

4 听觉毛细胞发育和再生过程中信号通路之间的相互作用

Notch和Wnt信号传导是耳蜗发育期间的前体细胞增殖和细胞再生过程中必不可少的信号通路。调节任一途径中的信号传导是毛细胞再生的潜在的研究方向。随着研究深入，最近发现Notch和Wnt信号在毛细胞发育和再生中有相互调控作用[13, 34]。抑制小鼠毛细胞有丝分裂时Notch传导，Wnt信号在Lgr5+支持细胞中被激活并促进它们进入细胞周期并分化成毛细胞，表明Notch信号传导对毛细胞祖细胞中的Wnt信号传导活性发挥起抑制作用；因此，通过干扰Notch和Wnt信号传导之间的相互作用来靶向两种途径提供了毛细胞有丝分裂发生的潜在方法。支持细胞中的Notch抑制和Wnt活化同时显著促进前庭毛细胞的有丝分裂生成，这比单独调节信号传导更有效[41]。

在小鼠内耳发育过程中，Shh通路与Wnt通路相互拮抗，同时Notch、FGF、BMP等多条信号通路形成了复杂的信号网络系统，共同调控和维持内耳发育。尤其在小鼠内耳D-V 轴的形成中Shh通路与Wnt通路起着决定性的作用，Wnt的靶基因主要位于背侧，Shh的靶基因主要位于腹侧，这也是耳蜗与前庭系统、听觉系统形成差异的关键因素，Shh通路与Wnt通路相互拮抗维持内耳形态发育的平衡，Shh信号通路通过抑制Dlx5/6，从而降低耳蜗背侧Wnt信号通路的活性；此外在缺乏后脑的内耳外植体中，腹侧Shh靶基因Pax2和Ngn1的表达沿着耳蜗的侧壁异位扩展，说明Wnt信号对腹侧Shh信号的表达有抑制作用[42]。

Shh信号通路、FGF信号通路和Notch信号传导靶基因相互作用以调控听觉毛细胞分化模式。在耳蜗前体细胞中，Shh信号通路通过维持Notch效应分子Hey1和Hey2的表达水平，负调节Atoh1表达以防止毛细胞过早分化，此外，Shh信号传导对Hey1和Hey2的正调节很可能是由FGF信号介导；因此，Shh信号-FGF信号-Notch效应物Hey1和Hey2-Atoh1可能是诱导毛细胞的潜在靶标[43]。通过中断这些信号传导途径之间的相互作用，抑制Shh信号传导和/或其下游途径与Atoh1过表达结合以刺激听觉毛细胞再生可能是可行的；然而，目前尚未研究该策略的有效性，并且需要进一步研究这些信号传导途径在损伤后毛细胞再生中的相互作用。

5 展望

Wnt、Notch、Shh信号通路在调控内耳发育、支持细胞和毛细胞增殖再生过程中起到不可或缺的作用，在可再生生物模型或哺乳动物模型中，通过控制耳蜗发育期间的前体细胞增殖和细胞再生过程中的信号通路，将是毛细胞再生的潜在研究方向。因此，深入了解毛细胞发育的细胞环境以及这些关键调节因子之间的相互关联对于研发治疗感音神经性听力损失的新策略将具有重要意义。