高效液相色谱法同时测定甜油中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠与脱氢乙酸

◎ 戚 繁，王少伟，颜春荣，徐春祥

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210000）

甜油是江苏省宿迁地区独有的调味品，是一种类似酱油却和酱油完全不同的佐料，能使菜肴变得特别鲜美。甜油既是凉拌菜的主要调料，也是烧制菜的配料，甜油的制作工艺既要求原汁原味，又要求保持各种营养成分；既要求无菌，又要求保留营养成分[1]。在含盐量较低、水分活性较高、气温适宜的条件下，微生物极易繁殖而霉变，为了防止产品变质，除了加热灭菌之外，还需添加相关的防腐剂，同时一些厂家为了改良甜油的口味，会加入相应的甜味剂。目前在我国食品行业内，山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、糖精钠、脱氢乙酸已广泛应用于调味品、乳及乳制品、碳酸饮料、果酒和葡萄酒。一定剂量范围内的食品添加剂对人体是无害的，既不会影响食品的营养价值，同时又具有防止食品腐败变质、增强食品感官性状或提高食品质量的作用[2]。但过量的食品添加剂对人体具有一定的毒性作用，容易损害人体的健康，因此卫生部在《食品添加剂使用卫生标准》中对其应用范围和使用限量都有明确的规定[3]。

国家对上述食品添加剂的检测现行标准有GB 5009.28-2016《食品中苯甲酸/山梨酸和糖精钠的测定》[4]，GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定》[5]，GB 5009.121-2006《食品中脱氢乙酸的测定》[6]。调味品中的食品添加剂常常是多项目的同时添加，分别对这几种添加剂进行检测，不但增加工作量，延长检测时间，也降低了检测效率。本研究结合实际工作需要, 采用高效液相色谱法同时分离测定甜油中3种防腐剂、2种甜味剂。

甜油作为酿造调味品，其制作工艺类似酱油，含有丰富的蛋白质、氨基酸和糖类、维生素等营养物质，根据GB 5009.28-2016的要求，酱油中苯甲酸、山梨酸糖精钠的检测前处理方法为加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液以沉淀蛋白，离心取上清[4]。安赛蜜、脱氢乙酸钠的均在水中易溶，因此可以采用相同的前处理方式。本研究针对甜油样品采用蛋白沉淀剂的前处理方式，以甲醇-乙酸铵作为流动相、紫外可变波长检测，对上述5种添加剂同时分析测定。方法快速准确，检出限能够达到国家单项标准要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

（1）仪器。Thermos高效液相色谱仪和二极管阵列检测器（DAD），梅特勒电子天平，MILLI Q型超纯水仪。

（2）试剂。甲醇（HPLC，TEDIA），乙酸钠（AR，国药集团化学试剂有限公司），0.02 mol·L-1乙酸铵溶液，亚铁氰化钾溶液，乙酸锌溶液，苯甲酸钠、山梨酸钾、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸钠标准品。

1.2 标准溶液配制

精密称取各标准品适量于10 mL容量瓶中，用水配制1 mg·mL-1标准混合储备溶液。再用水稀释成0.001、0.010、0.020、0.100 mg·mL-1和 0.200 mg·mL-1系列标准工作溶液，浓度由低到高进样，以待测物质峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.3 样品处理

称取10 g样品，于50 mL容量瓶中，加入2 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2 mL乙酸锌溶液，摇匀，以沉淀蛋白，加水定容至刻度，离心，取上清，经微孔滤膜过滤，滤液待上机分析。

1.4 色谱条件

C18色谱柱（symmetry shield RP18， 5μm，4.6×250 mm）；流动相为0.4%乙酸与0.02 mol·L-1乙酸钠∶甲醇=75∶25；流速1.0 mL·min-1；进样量5 μL；柱温30 ℃；检测波长230 nm、214 nm、293 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 波长的选择

取上述各标准品溶液于200～400 nm波长处进行扫描，绘制紫外-可见吸收光谱图，各组分的最大吸收波长见表1。现行国家标准中，苯甲酸、山梨酸、糖精钠检测波长为230 nm，安赛蜜为214 nm，脱氢乙酸为293 nm。本方法中使用的检测器为DAD检测器，因此可以提取3种波长下的色谱图，同时实现5种物质的定性及定量计算。

表1 各组分紫外最大吸收波长表

2.1.2 流动相及洗脱条件的选择

现行国家标准中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜的检测使用的流动相体系为甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵（6∶94）等度洗脱，脱氢乙酸检测使用的流动相体系为甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液（10∶90）。检验中发现，采用国家标准方法同时检验安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，分离度和理论塔板数均符合要求，分离所需时间为20 min，出峰顺序为安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠。采用国家标准方法检测脱氢乙酸时，会出现拖尾现象，理论塔板数低，影响定量分析。要同时测定上述5种添加剂，实验室对流动相比例及pH进行优化，采用甲醇-0.02 mol·L-1乙酸钠与0.4%乙酸（25∶75）等度洗脱，各主峰保留时间适宜，峰形较好，主峰与前面未知杂质分离度为大于3.5，达到基线分离，各主峰的分离度符合要求，且脱氢乙酸的峰形得到有效改善。标准溶液典型色谱图如图1所示。

图1 苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜与脱氢乙酸混合标准溶液色谱图

2.1.3 柱温的选择

现行国家标准中，上述5种添加剂的检测所采用的柱温均为30 ℃，实验室同样采用30 ℃对混合标准溶液进行分离测定。

2.2 标准曲线的绘制及检出限

将1.2中的系列浓度混合标准溶液以1.4色谱条件上机测定，以待测物质峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。5种食品添加剂在0.001～0.200 mg·mL-1浓度范围内的线性关系良好，线性方程和相关系数见表2。

表2 标准曲线试验结果表

2.3 回收率及精密度实验

以实验室已检甜油样品1号为代表样品，分别按照高、中、低3个浓度添加5种添加剂，按优化的色谱条件进行平行6次分析，考察本方法的回收率和精密度，结果见表3。

表3 回收率及精密度表（n=6）

2.4 样品测定

采用优化后的色谱条件，按照1.3中的前处理方法对实验室已采用国家标准方法对5种添加剂分别检测的3个样品进行重新检测，检测结果比对见表4。检出量的偏差均小于5.0%。

表4 新建方法与国家标准方法检测结果对比表

3 结论

采用蛋白沉淀剂的前处理方法，能有效去除基质影响，样品添加回收率良好。同时新方法可以快速同时测定5种添加剂，各组分之间分离好、峰形佳、检出限符合国家限度要求，且3批样品的测定结果与使用国家标准分别测定五种添加剂的结果一致，大大提高了工作效率。