醋酸杆菌辅助酶解法提取动物软骨中硫酸软骨素的研究

◎ 邹德生，谷 昊

（鞍山师范学院化学系，辽宁 鞍山 114005）

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一种酸性黏多糖，纯品为白色或淡黄色粉末，易溶于水不溶于有机溶剂，在动物软骨中含量丰富，具有促进软骨再生、预防角膜炎、抗血栓、调节血脂、抗感染，增强免疫功能抗肿瘤等生物学活性，可应用于临床药物与保健食品[1]。近年来，市场对硫酸软骨素的需求不断加大，呈现供不应求的局面[2]，我国是硫酸软骨素出口第一大国，但我国企业多采用浓碱浸提法生产，此方法存在得率低、纯度低、污染大、成本高等问题[3]，因此探索硫酸软骨素新的生产技术，减少生产成本和对环境的污染，提高产品得率和纯度，具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

（1）实验材料。猪、羊喉管软骨，购自学校周边屠宰场。

（2）实验试剂。醋酸杆菌，实验室自有；碱性磷酸酶、木瓜蛋白酶，购自厦门泰金生物技术有限公司；硫酸软骨素标准品，购自SIGMA公司；其他材料均为分析纯。

1.2 实验仪器

粉碎机FZ125（天津泰斯特仪器有限公司）、HH4数显水浴锅（国华仪器有限公司）、干燥箱ZB101（国华仪器有限公司）、离心机D-04B（日本东芝公司）、TU-1900紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、冷冻干燥机SCIENTZ-120（宁波新知生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 软骨预处理

取猪、羊软骨置于锅内煮沸约30 min，剔除杂质后粉碎，过筛后备用。

2.2 硫酸软骨素提取

取醋酸杆菌接种于200 g软骨粉中，于发酵罐中在35 ℃下处理24 h，取出后于95 ℃水浴灭活10 min。冷却后调节pH至10.5，加入一定浓度的碱性蛋白酶于37 ℃恒温处理数小时。再调节pH至6.4，加入木瓜蛋白酶于37 ℃水解数小时，后于80 ℃水浴灭活10 min。在4 ℃ 12 000 r·min-1离心 5 min后在上清液中加入活性炭低温静置2 h，用MNWC 6000中空纤维超滤器过滤[4]。在滤液中加入无水乙醇沉淀，真空干燥后即得硫酸软骨素纯品。

2.3 硫酸软骨素含量测定

采用间苯三酚法测定硫酸软骨素含量[5]，取硫酸软骨素标准品配制成20 mg·mL-1的溶液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8 mL和 1.0 mL放于 10 mL容量瓶中，加间苯三酚3 mL并加水1 mL，在废水浴中放置30 min，去除冷却后加冰醋酸至刻度，于558 nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线。

2.4 硫酸软骨素纯度测定

采用琼脂糖电泳法测定硫酸软骨素纯度[6]，配制0.75%的琼脂糖凝胶，以硫酸软骨素标准品为对照，每孔加30 μL提取液，用pH 8.6的电泳缓冲液电泳，电压150 V，电泳时间1.5 h。电泳完毕后染色，扫描后用BandScan软件分析纯度。

3 结果与分析

由于硫酸软骨素多糖与蛋白交联，研究表明温度超过60 ℃时，就会开始分解[7]，所以如长时间高温处理会影响产品纯度与收率，所以本实验采用醋酸杆菌和各种酶类的最适温度和最适pH，对醋酸杆菌浓度，碱性蛋白酶浓度和木瓜蛋白酶浓度3个因素进行了单因素实验。

3.1 硫酸软骨素含量的标准曲线

结果表明，硫酸软骨素浓度在0.1～1.0 mg·mL-1时，吸光度与浓度成正相关，如图1所示，相关方程为 y=0.664 9x-0.005 4，R2=0.998 9。

图1 硫酸软骨素含量的标准曲线图

3.2 醋酸杆菌浓度对提取率的影响

醋酸杆菌具有强力分解蛋白质的功能，可以用于分解软骨中的蛋白质成分。在6个小型发酵罐中分别加入200 g软骨粉，加入不同浓度的醋酸杆菌，浓度分别为 4、5、6、7 g/100 mL和8 g/100 mL，在 35 ℃下处理24 h，结果如图2所示。由实验结果可知，醋酸杆菌的最佳浓度为6 g/100 mL，继续增大醋酸杆菌浓度得率没有显著增加。

图2 醋酸杆菌浓度对提取率的影响图

3.3 碱性蛋白酶浓度对提取率的影响

查阅使用手册可知，此碱性蛋白酶的最适pH为11。取5个三角烧瓶，在发酵液中分别加入质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的碱性磷酸酶，在37 ℃，pH为11下酶解4 h，结果如图3所示。由实验结果可知，碱性磷酸酶的最佳浓度为1.5%，如继续增大酶浓度，得率不会继续增大。

图3 碱性蛋白酶浓度对提取率的影响图

3.4 木瓜蛋白酶浓度对提取率的影响

查阅木瓜蛋白酶使用手册可知，此酶最适pH为6.5。取5个三角烧瓶，在发酵液中分别加入质量分数为0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的木瓜蛋白酶，在37 ℃，pH为6.5的条件下酶解4 h，结果如图4所示。由实验结果可知，木瓜蛋白酶的最佳浓度为1.5%，继续增大酶浓度，产率下降，这可能是由于在酶浓度过高时，酶活力无法完全发挥反而成为一个杂蛋白而降低了得率。

图4 木瓜蛋白酶浓度对提取率的影响图

3.5 硫酸软骨素的纯度分析

经琼脂糖凝胶电泳后，得凝胶扫描图如图5，电泳图从左至右依次为标准品孔道，空白对照孔道，3次提取液样品孔道。由图5可知，试验中提取到的样品分子质量与标准品一致，在样品提取液孔道上方和下方有少量杂蛋白条带存在，经凝胶分析软件BandScan软件分析可知，样品纯度达到92.77%，已经可以满足出口要求。

图5 硫酸软骨素琼脂糖凝胶电泳图

4 结论

本实验研究了采用醋酸杆菌辅助酶解法提取硫酸软骨素的最佳工艺条件，结果表明在醋酸杆菌浓度6 g/100 mL，发酵温度35 ℃；碱性蛋白酶浓度1.5%，酶解时间4 h；木瓜蛋白酶浓度1.5%，酶解时间4 h，在此条件下硫酸软骨素提取为7.65%，纯度为90.77%。由结果可知，相比于目前广泛采用的浓碱浸提法，本法的硫酸软骨素产率比浓碱浸提法稍低，但是纯度远高于浓碱浸提法，而且本法具有成本低，操作简便，对环境污染小等优点。