大豆过敏原检测研究

◎ 赵小明

（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040）

大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]属于豆科植物的一种，数千年来一直被人类当作食物来食用。大豆中含有很多营养物质，约含有蛋白质39%，其中，部分是过敏原成分，如甘氨酸m3、m4，大豆球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。

大豆产品广泛应用于食品工业，作为增稠剂、乳化剂和蛋白填充机。对大豆过敏的人群必须严格避免食用大豆或含有大豆的食物。在食品生产加工过程中由于交叉污染会造成大豆残留在食物中很难排除，因此高灵敏度的检测方法对于大豆食品检测必不可少[1]。

1 检测原理

大豆检测试剂盒应用夹心法酶联免疫吸附原理（ELISA），提取缓冲液萃取的大豆蛋白与包被在微孔表面的大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）抗体反应。样品提取液或标准品加入到抗体包被的微孔中，大豆胰蛋白酶抑制剂将会结合到抗体上，经过一次洗板之后将大豆胰蛋白酶抑制剂抗体酶联偶合物加入到微孔上进行孵育培养。第二次洗板之后将酶底物加入，颜色变为蓝色。且颜色深浅与样品或标准品中大豆胰蛋白酶抑制剂含量成正比。加入反应终止液终止反应后，反应液颜色应由蓝色转为黄色。在450 nm（OD450）滤镜及630 nm示差滤镜下使用酶标仪测量微孔板吸光度值。以标准品吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品吸光度值与标准品吸光度值比较进行结果判读。

2 注意事项

注意事项如下：①试剂盒不使用时需放置在2～8 ℃保存，并确保在有效期内使用。②严格遵守说明书中注明的操作时间进行孵育，否则将导致实验结果不精准。③为了避免交叉污染，样品制备前必须将所有仪器彻底清洗。④反应终止液中含酸，避免直接接触皮肤及眼睛。若不小心溅到，及时用水冲洗。⑤在实验中应当自始至终穿戴橡胶手套、安全眼镜及实验外套。⑥检测完后需对所有材料、容器及设备作适当处理。

3 试剂准备

试剂准备如下：①提取缓冲液；用去离子水按照1∶10的比例稀释浓缩提取缓冲液，配制好的稀释缓冲液储存在4 ℃条件下，可以稳定保存1周。②清洗缓冲液；缓冲液放在冷冻条件下储存将会有晶体状沉淀，浓缩的缓冲液需要回温使其完全溶解，然后再与去离子水按照1∶10的比例稀释。配制好的稀释缓冲液储存在4 ℃条件下，可以稳定保存1周。

4 操作步骤

操作步骤如下：①获取具有代表性的样品，取5 g样品放在匀浆机或搅拌器上磨碎混匀。②称取1 g混匀样品，与20 mL稀释提取缓冲液涡旋混匀。③在60 ℃水浴锅中孵育15 min，每2 min充分振荡混匀一次。④2 000 r·min-1，离心10 min获得上清液，如果上清液中仍有颗粒物质，需要重新过滤上清液收集滤液；或者直接用滤纸过滤提取液，收集滤液准备检测。⑤测试样品的准备。取无颗粒上清液100 μL于孔中进行检测，如果样品中的过敏原含量超出定量范围，需要增加稀释比例，在计算样品中的浓度时需要将额外的稀释比例考虑在内。

5 检测流程

检测流程如下；在使用前，所有试剂及试剂盒内的材料必须恢复至室温（18～30）℃。建议若使用8道移液枪进行操作，在一次试验中样品及标准品的总量不超过48个（6条微孔）；若使用单道移液枪进行操作，在任何一次实验中样品及标准品的总量不要超过16个（2条微孔）。①将等量有抗体包被的微孔条放入微孔板架上，未使用的有抗体包被的微孔条需放回装有干燥剂的原铝箔袋内并密封保存。②使用单道移液器吸取准备好的样品或者标准品100 μL于抗体微孔中，每移取一个标准品或样品，单道移液枪必须更换新吸头。注意确保最后将吸头中的液体排空。③室温条件下孵育20 min，不要摇动微孔板，以免引起孔与孔之间的污染。④将孔中的液体甩入水槽中，用300 μL冲洗缓冲液冲洗每个孔，然后将微孔中的水甩入水槽中。如此反复冲洗3次。注意：在冲洗过程中不要将微孔条从微孔板架上取下，每条微孔条带应被固定在微孔板架上。⑤第3次洗板完毕后，将几张吸水纸巾放置在平整的桌面上，使微孔板倒置扣在纸面上，以尽可能地将残留的水分排出。用干布或纸巾擦干微孔板底反面的水珠。⑥按照约120 μL/孔或1 mL/条的体积计算所需的酶联偶合物用量。从绿色瓶盖的瓶内量取所需用量的酶联偶合物至另外一个独立的容器中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），移取100 μL酶联偶合物至每个微孔中。⑦按照120 μL/孔或1 mL/条的体积计算所需的底物用量。从蓝色瓶盖的瓶内量取所需用量的酶底物至一个底物试剂槽中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），移取100 μL酶底物至每个微孔中，室温避光孵育20 min。⑧按照120 μL/孔或1 mL/条的体积计算所需的终止液用量。从红色瓶盖的瓶中量取所需用量的终止液至一个终止液试剂槽中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），依序（顺序与加入底物的顺序相同）向每个微孔中加入100 μL终止液终止反应。颜色应由蓝变黄。⑨用酶标仪在450 nm滤镜及示差滤镜630 nm下读取结果，记录每个微孔的吸光度OD值。在读取数据前，微孔中应没有气泡，否则将影响分析结果。

另需注意：不能将任何未使用的或用剩的试剂倒回原装瓶中。检验过程中应分清样品与标准品的位置。且在整个检验过程中，任何时候都不允许摇动微孔板以混合孔内液体。

6 结果判读

直接用标准品的吸光度值或者用相对于1 000 μg·kg-1标准品的吸光度值的百分数建立5个标准品的标准曲线。由于各标准品中的大豆胰蛋白酶抑制剂含量已知，则未知样品大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度即可通过此标准曲线获得。结果也可通过RomerLog/Logit软件计算得出，如果使用Log/Logit软件计算结果，其标准曲线的线性相关系数不得低于0.985，若标准品1 000 μg·kg-1的吸光度值低于0.7，即表示试剂已变质，请勿继续使用；若样品所含大豆胰蛋白酶抑制剂浓度高于标准品的最高浓度（＞1 000 μg·kg-1），则需将提取过滤的溶液利用更多的提取缓冲液稀释到试剂盒检测范围40～1 000 μg·kg-1以内，重新检测以得到精确结果。在最后的结果计算中，注意要将稀释倍数算入。

此试剂盒是用于对样品中大豆胰蛋白酶抑制剂的测定，而大豆胰蛋白酶抑制剂只是大豆蛋白的一种，若要进行其他特殊蛋白产品的测定可参考表1的验证数据。

表1 大豆衍生品中大豆产品含量的测量参考数据表

7 检测结果

选取本公司所生产的可能含大豆过敏原的品种原料以及生产设备、清洁洗涤水进行检测（试剂检出限：0.24 mg·kg-1），其结果如表 2。

表2 可能含有大豆过敏原的样品检测表

通过检测证明汤臣倍健股份有限公司产品所含大豆过敏原是合格的，不会给一般食用人员带来潜在危害。

8 结语

通过对食品或保健食品中所含大豆过敏原的检测，能够提前发现食品安全风险，防止给具有此类过敏体质的食用人群带来安全风险。