产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的诱变育种

◎ 尤丽新，胡楠楠，班 硕，孙永杰

（1.长春科技学院生物食品学院，吉林 长春 130600；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

食品在储藏过程中常用化学防腐剂防腐保鲜，但会出现致癌中毒现象,所以人们更倾向于天然防腐剂。目前天然抗菌防腐剂主要有植物源、动物源、微生物源抗菌防腐剂，目前微生物防腐剂主要有溶菌酶、乳酸链球菌素、纳他霉素、红曲素及ε-聚赖氨酸。ε-聚赖氨酸是一种广谱抑菌剂，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌和一些耐热性芽孢杆菌等，安全性能高，可以用于多种食品的保鲜。本试验在确定实验室购买的白色链霉菌具有合成ε-聚赖氨酸能力的基础上，对菌株进行紫外线诱变育种，以提高产物产量[1-4]。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

白色链霉菌（Streptomyces albulus），实验室购买菌种，具有产ε-聚赖氨酸的能力。

1.1.2 试剂

酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、蛋白胨、甲基橙、诱惑红、ε-聚赖氨酸、亚甲基蓝、碘和次硝酸铋等[5]。

1.1.3 溶液

① 0.7 mmol·L-1磷 酸 缓 冲 液（pH=6.9）。②1 mmol·L-1甲基橙试剂。③生理盐水（0.85%）。④改良的碘化铋钾试液。⑤碘化钾-碘试液。

1.1.4 实验仪器

分析天平、电子天平、显微镜、冰箱、培养箱、离心机、净化工作台、鼓风干燥箱、酸度计、振荡器、紫外可见分光光度计和压力蒸汽灭菌器。

1.1.5 培养基

①高氏一号培养基。②贝特纳培养基。③液体发酵培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌体活化

采用高氏一号斜面培养基进行菌体活化，活化后菌株于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 分离纯化菌种

取活化后的斜面种子一环，接种于斜面培养基（贝特纳培养基），培养温度30 ℃，培养6～7 d。

1.2.3 诱变育种[6-8]

（1）单孢子菌悬液的制备。待分离纯化斜面菌种孢子成熟铺满斜面，用0.85%的无菌生理盐水清洗孢子，调整孢子浓度为108个/mL（显微镜涂片计数法）。

（2）样品的稀释。将单孢子悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5以及 10-6系列稀释菌液，选择 10-3、10-4、10-5稀释度，分别做平板接种培养及诱变处理。

（3）紫外诱变处理。打开紫外灯预热20 min，培养皿里放入转子，分别吸取菌悬液9 mL移入无菌培养皿中，将带有菌悬液的培养皿放置在距15 W紫外灯下30 cm处，打开磁力搅拌器，开始计时，边搅拌边照射，照射时间分别为15、25、35、45 s以及55 s，照射完毕，关闭紫外灯。所有操作必须在红灯下进行。取稀释度10-3、10-4、10-5（分别经过 15、25、35、45 s以及 55 s诱变处理）各0.1 mL移入贝特纳平板上，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，然后30 ℃、避光条件下培养72 h后进行菌落计数。

（4）计算存活率和致死率。对培养后的平板进行菌落计数。以对照组平板菌落数为基准，计算出经紫外处理15、25、35、45 s以及55 s后每毫升菌液中的活菌数和致死率。

1.2.4 突变菌株初筛

亚甲基蓝是一种碱性染料，而菌体会分泌产生带正电的产物ε-聚赖氨酸，由于静电作用，会排斥亚甲基蓝，进而菌体周围会形成蓝色较浅的透明圈。所形成的透明圈的直径与菌体直径比值（HC值），与对照平板进行比较，一般HC值越大，则说明ε-聚赖氨酸产量越大；HC值越小，则产量越小。可将HC比值作为鉴定高产ε-聚赖氨酸菌株的指标[9]。

1.2.5 突变菌株摇瓶发酵（复筛）

分别将原菌株与经诱变初筛的菌株接入装有40 mL发酵培养液的250 mL三角瓶中，在空气浴震荡器培养72 h，温度 30 ℃，转速 200 r·min-1。

1.2.6 ε-聚赖氨酸含量的测定

用分光光度计测定ε-聚赖氨酸的含量，参照Itzhak和Shima甲基橙比色法。以磷酸缓冲液为空白样，在465 nm下测定样品吸光度，以A465为纵坐标，ε-聚赖氨酸含量为横坐标，绘制ε-聚赖氨酸标准曲线。

将诱变前后菌株进行摇瓶发酵3 d后，发酵液经过处理，稀释20倍后测定OD425值，最后根据标准曲线计算出发酵液中ε-聚赖氨酸的含量。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变剂量的确定

以白色链霉菌作为出发菌株，进行紫外线诱变，紫外线诱变致死率曲线如图1。紫外诱变后菌体长势情况如图2。

图1 紫外诱变致死率曲线图

图2 紫外诱变菌体长势情况图

由图1看出，根据遗传育种的经验，70%～80%的致死率最好，因此确定以35 s为最适诱变剂量。

2.2 突变菌株初筛

用含甲基蓝的贝特纳琼脂培养基培养紫外诱变处理35 s后的菌株，其菌落周围出现颜色较浅的透明圈，结果见图3。

图3 菌体产物与亚甲基蓝的静电反应图

由图3可见，菌落周围出现颜色较浅的透明圈，从培养菌株中选择HC比值最大（3.3）的菌株做进一步摇瓶复筛。

2.3 发酵液中ε-聚赖氨酸含量测定

ε-聚赖氨酸标准曲线方程。ε-聚赖氨酸标准曲线方程为y=-1.452x+0.498，R2=0.995 5。

诱变前后发酵液中ε-聚赖氨酸含量如表1。

表1 诱变前后ε-聚赖氨酸含量表

诱变前后发酵液OD值分别为0.427、0.407，代入ε-聚赖氨酸标准曲线方程y=-1.452x+0.498，得出ε-聚赖氨酸含量为 0.049 g·L-1、0.063 g·L-1。进而得出发酵液中 ε-聚赖氨酸含量为 0.98 g·L-1、1.26 g·L-1，诱变后产量提高率为28.57%。

3 结论

本试验对该产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌采用紫外线诱变法进行诱变处理，确定最佳诱变时间为35 s，此时突变菌株ε-聚赖氨酸的产量为1.26 g·L-1，与未诱变前比产量提高了28.57%。