Thermoascus aurantiacus产耐热木聚糖酶水解活性的培养条件优化

■管国强 方 华 王美娟 毕 芳 崔凤杰* 孙中超 朱校适 郭子好

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江苏盐城源耀生物科技有限公司，江苏盐城224000；3.北京中医大学东方学院中西医结合临床教研室，河北廊坊065001）

嗜热细菌和真菌是潜在的生产耐热木聚糖酶菌株[4-5]。如热袍菌属的海栖热袍菌(Thermotoga maritima)可产生分子量分别为120 000和40 000的耐热β-1,4-木聚糖酶[6]。另外，嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）、嗜热棉毛菌（Thermomyces lanuginosus）、嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila）和嗜热侧孢霉（Thermophilic sporotrichum）等嗜热真菌也已被证实可产耐热木聚糖酶[7-8]。通常，营养成分（如培养基的组成、浓度水平等）和培养条件（如发酵温度、时间、接种量、通气、搅拌等）直接影响真菌木聚糖酶的表达和分泌[9]。因此，为提高嗜热真菌产酶水平，了解菌株生长和产酶效率之间的关系，需对其发酵产酶条件进行系统优化。在木质纤维素原料中，由于木聚糖酶与半纤维素木聚糖分子间存在着空间位阻，使得木聚糖酶与底物不能充分接触，当同时存在纤维素酶与木聚糖酶时，木聚糖酶的空间阻碍明显减小，因此可显著提高半纤维素的水解效率[10]。

目前国内外关于嗜热子囊菌产木聚糖酶的文献主要集中在其固态发酵产酶条件的优化与控制等方面。例如，Jain等[11]在德里大学南校区土壤中筛选得到T.aurantiacusRCKK，在优化的固态培养条件下，CMC酶活、FPA、β-葡萄糖苷酶酶活和Xyn酶活均达到最大值，分别为88、15.8、25.3 U/g和6 543 U/g。周秀梅等[12]研究发现，T.aurantiacus的固态发酵产Xyn最大活性可达10 321 U/g；而庞宗文等[13]筛选到T.aurantiacusQS7-2-4在优化的固态发酵条件下，Xyn活性达到27 952 U/g。

本课题组前期采用稀释涂布、刚果红染色以及胞外酶活测定等步骤筛选到产耐热木聚糖酶的菌株，经形态学、ITS序列同源性和系统进化树等分析确定其为嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacusCGMCC11334）[14-15]，并单因素实验优选其产木聚糖酶的条件为：初始pH值4.5、接种量10%、摇床转速200 r/min、培养温度45℃、培养时间8 d。然而，关于嗜热子囊菌深层发酵产耐热木聚糖酶及其水解能力的条件仍需进一步系统研究。因此，本文在前期研究的基础上，采用正交实验和主成分分析构建综合水解能力指数，并优化所产木聚糖酶最大水解玉米芯能力时的培养基组成，以期为获得最大化产酶条件及其应用于农副产物水解生产寡聚木糖等方面提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

T.aurantiacusCGMCC11334由江苏大学生物工程研究所选育，专利保存中国普通微生物菌种保藏管理中心。

种子培养基（g/l）：葡萄糖15.0、小麦蛋白胨4.0、KH2PO41.0、Na2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、微量元素1.0 ml/l[微量元素营养液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、Mn-SO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]，自然pH值。

液体产酶培养基（g/l）：麸皮10.0、小麦蛋白胨1.0、酵母膏1.0、KH2PO42.0、CaCl20.3、(NH4)2SO41.4、MgSO4·7H2O 0.3、吐温-80 1.0 ml，微量元素1.0 ml/l[微量元素营养液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、MnSO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]。

1.2 培养方法

T.aurantiacus经活化后，切取5 mm×5 mm的新鲜菌块置于PDA培养基上，于45℃的恒温培养箱中培养7 d；接入5块5 mm×5 mm菌块于种子培养基（装液量为100 ml/250 ml）中，45 ℃、180 r/min摇床培养3 d，制得种子液；将种子液按10%（v/v）的接种量转接至发酵培养基中，摇床（45℃，180 r/min）培养8 d。

1.4 正交实验设计

根据单因素优化结果[14-15]，选取麸皮、微晶纤维素、牛肉浸膏、玉米浆、小麦蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、FeSO4和VB1作为自变量，设计一个10因素5水平共50组实验的正交实验表L50(510)，分别测定Xyn、FPA、CMC活性和总的还原糖得率，实验设计的因素水平见表1，采用正交实验设计助手和SPSS17.0对正交实验结果进行分析。

表1 实验设计的因素水平(g/l)

1.5 分析方法

1.5.1 酶活测定

FPA活性的测定[16]。设空白组：1.5 ml pH值4.8的缓冲液；底物对照组：1.5 ml pH值4.8的缓冲液+50 mg滤纸条；酶对照组：1.0 ml pH值4.8的缓冲液+0.5 ml粗酶液；实验组：1.0 ml pH值4.8的缓冲液+50 mg滤纸条+0.5 ml粗酶液。将空白组、对照组和实验组同时放入50oC水浴锅中保温60 min，反应结束后，立即加入3.0 ml DNS混匀，沸水浴5 min，迅速冷却至室温。取0.2 ml反应物加2.5 ml水稀释，在540 nm处测吸光度值，用空白组调零。

CMC酶活的测定。设空白组：1.5 ml pH值4.8的缓冲液；底物对照组：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml pH值4.8的缓冲液；酶对照组：0.5 ml酶液+1.0 ml pH值4.8的缓冲液；实验组：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml酶液。将底物对照组、酶对照组和实验组三组试管同时放入50oC水浴锅中水浴30 min，水浴结束后，立即加入3.0 ml DNS混匀，沸水浴5 min，冷却至室温。取0.2 ml混合物加2.5 ml水稀释，然后在540 nm处测吸光度值，用空白管调零。

Xyn活性的测定[17]。设空白组：2.0 ml pH值5.3的缓冲液；底物对照组：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml pH值5.3的缓冲液；酶对照组：1.0酶液+1.0 ml pH值5.3的缓冲液；实验组：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml粗酶液；将底物对照组、酶对照组和实验组3组试管同时置于50℃水浴30 min，水浴结束后。立即加入3.0 ml DNS混匀，沸水浴5 min，迅速冷却至室温，加蒸馏水稀释至25 ml。然后在540 nm处测吸光度，用空白管调零。

在一定的温度及pH值条件下，每毫升酶液，每分钟水解相应底物，产生1 μmol还原糖（葡萄糖/木糖），定义为一个酶活力单位(U)。

1.5.2 糖得率的测定

甜玉米（黄色）购自江苏旅游超市（镇江江大店），去除籽粒，将玉米芯置于60℃的烘箱中烘至恒重，用小型的粉碎机将烘干后的玉米芯粉碎，过40目筛保存备用。经测定[18]，玉米芯含有38%的半纤维素，35%的纤维素，22%的木质素以及少量的灰分。

发酵液水解玉米芯糖得率的测定步骤主要包括：将粉碎后的玉米芯在60℃的热水中浸泡12 h，使其充分的溶胀，取残渣烘干；将烘干的玉米芯按1∶25（w/v）加入水解反应体系（24 ml pH值5.3的柠檬酸盐缓冲液和1.0 ml酶液），于50 ℃、200 r/min反应4 h；采用DNS法测定上清液中还原糖的含量（以木糖计，mg/ml）[19]。

1.6 数据处理

所有实验的数据均重复测定3次，采用Excel 2007统计分析软件处理，结果以“平均值±标准差（X±SD）”表示；利用Origin 8.6绘制曲线。

2 .结果与分析

2.1 主成分提取法构建木聚糖酶综合水解能力指数

根据单因素实验的结果，设计了以麸皮、微晶纤维素、牛肉浸膏、玉米浆、小麦蛋白胨、KH2PO4、Mg-SO4、CuSO4、FeSO4和VB1等10个因素为自变量，Xyn、CMC和FPA酶活这3个指标为因变量的正交实验L50(510)，实验结果见表2。

表2 正交实验结果L50(510)

表2 （续） 正交实验结果L50(510)

玉米芯的主要成分包括木聚糖、纤维素和少量的木质素。纤维素的水解可以增加木聚糖酶和木聚糖的接触面积，同时降低纤维素对木聚糖酶的非反应性吸附，从而增加木聚糖的水解，因此在制备高活性的木聚糖酶时，同时适当增加纤维素酶的活性有利于提高以玉米芯为底物的还原糖得率。下面以Xyn、CMC和FPA酶活性及其交互作用为变量，采用主成分提取法构建木聚糖酶综合水解能力指数（XCHI）。

首先利用SPSS软件对三种酶的独立作用及交互作用等9个变量进行相关性分析，得到各变量之间的相关系数矩阵。由表3可知，有多个变量间存在着显著的相关关系，因此可以进行主成分分析，对9个变量进行缩减。

表3 变量间相关系数矩阵

为了进一步确证主成分分析的可行性，对实验数据进行了KMO检验和Bartlett球形度检验。由表4可知，取样足够度的Kaiser-Meyer-Olkin，KMO值为0.774，大于0.7；Bartlett球形度检验结果显示，近似卡方值为1 043.246，说明取样量充足，差异极显著(P＜0.01)，这两项检验结果证明这9个变量间存在着相关关系，因此适合做主成分分析。

表5显示有3个主成分的特征根大于1，因此可以提取三个主成分，这三个主成分的累积贡献率达到98.821%，因此说明这三个主成分的解释率达到98.8%。

表4 KMO和Bartlett检验

表5 因子的特征值与累积贡献率

经过方差最大正交旋转后的载荷矩阵见表6。旋转后，矩阵结构简化，含义明确。主成分1主要用于解释Xyn、CMCXyn、FPAXyn和XynXyn；主成分 2在CMC、FPACMC、CMCXyn和CMCCMC上有较大的载荷；而主成分3则可以用来代替FPA和FPAFPA的作用，说明提取的这三个主成分完全可以用来解释9个变量。

表6 旋转后的载荷矩阵

根据成分得分系数矩阵（表7），可得到每个主成分的方程式：

其中，X1是指FPA酶活的作用，X2指CMC酶活的作用，X3指Xyn酶活的作用，X4指FPA酶活与CMC酶活间的交互作用，X5指FPA酶活与Xyn酶活间的交互作用，X6指CMC酶活与Xyn酶活间的交互作用，X7指FPA酶活内部的交互作用，X8指CMC酶活内部的交互作用，X9指Xyn酶活内部的交互作用。

根据每个主成分的贡献率以及总的贡献率可得到关于综合水解能力的方程XCHI=(66.848×F1+18.762×F2+13.217×F3)/98.821=0.676×F1+0.190×F2+0.134×F3。将每组实验得到的9个变量的数值代入方程即可用XCHI表示。

表7 成分得分系数矩阵

2.2 XCHI适用性验证

为了检验XCHI的适用性，实验以XCHI为自变量，发酵液水解玉米芯的总还原糖得率为因变量，进行回归分析（见表8）。模型拟合的结果见表9，相关系数R为0.937，说明综合水解能力A可以很好的解释最终的总还原糖得率，解释率高达97.3%。R2与调整R2的值很接近，分别为0.878和0.873，说明模型拟合的较好。

方差分析结果见表10，F值为169.119，P＜0.05，说明该回归模型达到极显著水平，具有统计学意义。

表8 综合水解能力

表9 模型的构建

表10 拟合模型方差分析结果

表11 模型中各系数的检验结果

由表11可知，常数项和各系数项均显著，最终得到糖得率与综合水解能力XCHI的回归方程，Y=10.824+0.032XCHI+(-7.328×106)XCHI2，而二次项系数极小，因此可以忽略。该结果说明XCHI可以作为指数用于优化木聚糖酶水解玉米芯能力的综合指数。

2.3 以XCHI为指标优化合成最大木聚糖酶活性的最适条件(见表12)

验证结果表明，建立的模型具有良好的可行性。因此，以XCHI为响应值，对50组正交实验进行直观分析，得到10个因素的影响力大小依次为D＞A＞J＞F＞E＞G＞H＞B＞C，确定木聚糖酶水解活性最大的培养基组成为A5B2C5D4E5F3G5H1I2J4，即麸皮16 g/l、微晶纤维素7 g/l、牛肉浸膏4 g/l、玉米浆3 g/l、小麦蛋白胨4 g/l、KH2PO41.0 g/l、MgSO42.0 g/l、CuSO40.00 g/l、FeSO40.05 g/l、VB10.15 g/l。在优化的条件下，Xyn、CMC和FPA的酶活分别为135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml；分别比优化前提高了291.3%、33.8%和165.4%，经计算XCHI为1 649.44。

表12 综合水解能力的直观分析

3 结论

本文利用单因素实验优选了耐热菌株产木聚糖酶的条件，在此基础上，比较系统地采用正交实验和主成分分析构建综合水解能力指数和优化所产木聚糖酶最大水解玉米芯能力时的培养基组成为（g/l）：麸皮16、微晶纤维素7、牛肉浸膏4、玉米浆3、小麦蛋白胨4、KH2PO41.0、MgSO42.0、CuSO40.00、FeSO40.05 和VB10.15。在此条件下，Xyn、CMC和FPA的活性分别为135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml，XCHI为1 649.44，为获得最大化产酶条件及其应用于农副产物水解生产寡聚木糖等方面提供一定的技术支持。