响应面法优化液态发酵产多肽条件及其抗氧化性能初探

■田苗苗 毛思宇 王 伟

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

蛋白质经降解后，抗氧化活性较强的疏水性氨基酸侧链基团暴露出来，得到的多肽和小肽的抗氧化能力要优于蛋白质和氨基酸。一般抗氧化活性较强的蛋白质降解产物由3～6个氨基酸组成，相对分子质量小于600～2 000[1]。与普通大豆相比，黑豆蛋白的蛋白质和疏水性氨基酸含量均有明显的提高，更有利于开发成具有生物活性肽类产品[2]。微生物发酵可产生复合酶系，能够有效降解蛋白质，且反应温和，通过微生物调节酶系，生产效率更高。微生物发酵中各种发酵条件影响最终的发酵效果。响应面法（Response Surface Methodology，RSM）是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可以连续地对试验因素的各个水平进行分析，改变了正交试验只能单纯对孤立试验点进行分析的不足，更有助于发酵条件的优化，且所得图形直观，因此被广泛应用于众多领域的试验设计与工艺优化研究中[3-5]。河北农业大学生命科学学院实验室在前期工作中得到了一株高产蛋白酶菌株B-5（Bacillus sp.）并对其产酶性能进行了研究。本研究以肽转化率为指标，拟采用单因素试验，分别对碳源种类、碳源含量、氮源含量、装瓶量、培养温度、培养时间及接种量等因素进行考察，以确定其对于B-5液体发酵产多肽的影响，最终确定影响最显著的3个因素，根据Box-Benhnken设计原理设计试验，建立肽转化率为响应值的回归方程模型，利用Design-Expert得到最优液体发酵条件，为放大试验提供依据。

1 试验材料

1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌菌株B-5：由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。

1.2 培养基

NA、NB培养基的配制方法具体参见《微生物学实验技术》[6]。

基础发酵培养基：黑豆蛋白10%，0.84%Na2HPO4，0.032%KH2PO4，0.17%CaCl2，混匀后调 pH值6.0～6.5，115 ℃灭菌30 min。

2 试验方法

2.1 菌种扩培及种子培养

配制NA培养基，分装于试管后121℃湿热灭菌20 min，趁热摆斜面。在无菌环境下，将实验室已有菌株B-5菌株接种于NA培养基斜面上，37℃培养24 h。将培养后的B-5菌株接种于NB培养基中，装液量为75 ml/250 ml三角瓶，180 r/min摇床培养14 h，得到种子液。

2.2 发酵条件的影响试验

根据相关试验方案设计来进行相关试验。在优化培养基组成时均采用以下培养条件：将种子液以2%的接种量，接入75 ml/250 ml三角瓶发酵培养基中，37℃、180 r/min振荡培养48 h后，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液进行冷冻干燥，分别进行肽转化率的测定。

2.3 单因素试验

2.3.1 不同碳源的影响

分别以浓度为2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等供试碳源配制7种不同的发酵培养基，均加入10%黑豆蛋白、0.8%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.2%CaCl2，混匀后调 pH 值6.5，发酵后以肽转化率为指标考察菌株B-5对不同碳源的利用情况。比较，筛选出最适的碳源。

2.3.2 单因素试验

分别以碳源含量、氮源含量、装瓶量、接种量、培养温度和发酵时间作为考察因素，以肽转化率为指标考察各因素的合适范围。

2.3.3 响应面试验

综合单因素试验的结果，选取其中3个主要影响因素进行响应面试验(见表1)。以肽转化率为指标，采用Design-Expert 8.0.6中关于响应面的部分，根据Box-Behnken设计原理，对发酵条件进行设计、分析和优化。

表1 Box-Behnken响应面试验设计因素与水平

2.4 肽转化率和DPPH清除率的测定方法

2.4.1 总蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法测定。

2.4.2 酸溶蛋白质的测定

将发酵液经三氯乙酸处理后，采用凯氏定氮法测定酸溶蛋白质含量。

2.4.3 游离氨基酸含量的测定

采用甲醛滴定法测定。

2.4.4 肽转化率

肽含量为上清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量。

式中：m1——酸溶蛋白质含量（g）；

m2——游离氨基酸含量（以粗蛋白质计，g）；

m——原黑豆蛋白质含量（g）。

2.4.5 DPPH清除率的测定方法[7]

分别取优化前后的样品各0.5 g，加入蒸馏水稀释至浓度为5 mg/μl的样品溶液。分别取样品溶液1.0 ml和0.4 mmol/l的DPPH溶液0.5 ml依次加入到试管中，震荡均匀，放于37℃水浴中保温，避光反应30 min。将反应后的溶液用分光光度计在517 nm测得A，同时以无水乙醇做空白对照，测得A0，采用下列公式计算DPPH清除率。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图1)

B-5菌株可以利用多种碳源发酵后降解大分子蛋白为多肽，从图1可以看出B-5菌株发酵产多肽的最适碳源为蔗糖。

图1 不同碳源的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 碳源含量(蔗糖浓度)对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图2)

图2 不同碳源含量的影响

从图2可以看出，不同的蔗糖含量对于B-5菌株发酵产多肽有明显的影响，肽转化率随着蔗糖含量的增加而增加，蔗糖含量为3%之后缓慢降低，因此最终选择碳源最佳含量为3%。

2.2.2 氮源含量（黑白蛋白浓度）对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图3)

从图3可以看出，不同的氮源含量对于B-5菌株发酵产多肽有明显的影响，氮源含量为2%～11%时，肽转化率随着氮源含量的增加而增加，之后缓慢降低，因此氮源的最佳含量为11%。

图3 不同氮源含量的影响

2.2.3 装瓶量对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图4)

图4 不同装瓶量的影响

从图4可以看出，装瓶量对B-5菌株发酵产多肽量的影响不明显。装瓶量为75 ml/250 ml时，肽转化率较高，因此选其为最适装瓶量。

2.2.4 接种量对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图5)

图5 不同接种量的影响

从图5可以看出，接种量对B-5菌株发酵产多肽量的影响较明显。接种量为4%～6%时，肽转化率增加明显，之后有所下降，因此接种量为6%时，肽转化率最高。

2.2.5 培养温度对B-5菌株发酵产多肽的影响(见图6)

图6 不同培养温度的影响

从图6可以看出，35℃以后，肽转化率较平稳，因此选择最佳发酵温度为35℃。

2.2.6 发酵时间对B-5菌株发酵产多肽的影响（见图7）

随着发酵时间的增加，B-5菌株产生蛋白酶等酶类，可以将大分子蛋白有效进行降解，从图7可以看出，72 h之后，肽转化率变化不大，因此选择最佳发酵时间为72 h。

图7 不同发酵时间的影响

2.3 响应面试验结果

2.3.1 B-5菌株产多肽响应面试验方案及结果

根据单因素试验的相关结果，确定蔗糖含量、氮源浓度和接种量为影响B-5菌株发酵降解蛋白质为多肽的3个主要影响因素。以肽转化率为响应值，依据Box-Behnken设计原理进行相关试验，结果如表2所示。

表2 以肽转化率为响应值的B-5菌株产多肽响应面试验方案及结果

采用Design-Expert 8.0.6软件，对响应面试验数据进行多元回归拟合。以肽转化率为响应值（Y），蔗糖含量（A）、氮源浓度（B）、接种量（C）为自变量，建立回归方程如下：

对表2中的试验结果进行方差分析，结果如表3所示。液体发酵产多肽响应面试验模型的显著水平＜0.000 1，失拟项0.062 9＞0.05，说明此回归模型较为理想。模型中A、B、C的一次项和二次项均显著（P＜0.01或P＜0.05），表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小，可以用该方程对不同发酵条件下的Y值进行预测。二次响应面回归模型的决定系数R2值为0.985 8（软件自动计算得出）。说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以用于该菌株发酵产多肽的理论预测。

2.3.2 B-5菌株产多肽响应面分析

利用Design-Expert 8.0.6对表2数据进行二次多元回归，拟合得到二次回归方程的响应曲面及其等高线(见图8～图10)。每个响应面分别代表2个独立变量之间的相互作用，第3个变量保持在0水平。

表3 B-5菌株产多肽响应面试验的方差分析

图8 蔗糖含量和黑豆蛋白含量对B-5菌株发酵产多肽的影响

从图8可以看出，蔗糖含量与黑豆蛋白含量的影响极显著(P＜0.01)，响应值变化幅度较大，曲线较陡，沿蔗糖含量方向的等高线密度大于沿黑豆蛋白含量方向的等高线密度，说明两者中蔗糖含量对肽转化率的影响更明显。从图9可以看出，蔗糖含量与接种量的影响显著(P＜0.05)，响应值变化幅度较大，曲线较陡，沿蔗糖含量方向的等高线密度大于沿接种量方向的等高线密度，说明二者中蔗糖含量对肽转化率的影响更明显。从图10可以看出，黑豆蛋白含量与接种量含量的影响极显著(P＜0.01)，响应值变化幅度较大，曲线较陡，沿黑豆蛋白含量方向的等高线密度大于沿接种量方等高线的密度，说明二者中黑豆蛋白含量对肽转化率的影响更明显。

2.3.3 B-5菌株产多肽响应面结果的优化分析和条件验证

图9 蔗糖含量和接种量对B-5菌株发酵产多肽的影响

图10 黑豆蛋白含量和接种量对B-5菌株发酵产多肽的影响

综上所述，回归方程对B-5菌株产多肽响应面试验拟合良好，可用此回归方程对B-5菌株产多肽响应面试验结果进行优化分析。采用Design-Expert8.0.6软件获取肽转化率的极大值，结果为蔗糖含量2.06%，黑豆蛋白含量11.35%，接种量7.19%，肽转化率为68.035%。考虑试验的实际情况，确定蔗糖含量2.1%，黑豆蛋白含量11.4%，接种量7.2%，此时肽转化率预测值达到68.029%。在该条件下进行试验，测定该菌株发酵的肽转化率为（67.921±0.81）%。采用基础发酵培养基培养该菌株发酵得到肽转化率为（39.35±0.31）%，故优化后肽转化率提高了72.61%。

2.4 体外抗氧化活性的测定

以DPPH消除率为指标，分别对优化前后得到的发酵产物的抗氧化性能进行测定，优化前的样品1的清除率为52.31%，优化后样品2的清除率为79.12%，与优化前相比，提高了51.25%。

3 讨论与结论

黑豆质硬、难于消化，且口感不佳，除少量药用或加工成豆豉等食品外，开发程度一直较低。黑豆蛋白含量高，营养好，是一类重要的植物蛋白资源[8]，经微生物发酵产生黑豆肽可以提高蛋白质利用率并使得产物具有抗氧化性能、降低胆固醇、缓解疲劳、辅助降血脂等特殊活性[9]。本研究采用单因素法和响应面法对B-5菌株的发酵培养条件进行了优化，并采用DPPH法对优化后发酵产物的抗氧化性能进行了测定，确定当蔗糖含量2.1%，黑豆蛋白含量11.4%，接种量7.2%，测定该菌株发酵的肽转化率为（67.921±0.81）%，与优化前相比提高了72.61%，且优化后发酵产物的清除率为79.12%，与优化前相比，提高了51.25%，为进一步分离抗氧化肽并对其结构进行鉴定建立了基础。