冠心病患者外周血循环内皮微粒水平检测及意义

李南 王小敏 钟昌宝 龙邦盛 张美萃

海口市中医医院1检验科，2重症医学科，3肺病心病科（海口570216）

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（coronary heart disease，CHD），是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病［1-2］。CHD及其心血管后遗症仍然是全世界死亡的首要原因，且CHD发生率与死亡率呈现逐年上升的趋势［3］。因此研究CHD发病机制、早期诊断和治疗具有重要的显示意义。内皮细胞源性微粒（endothelial cell-derived microparticles，EMPs）是内皮细胞在激活、损伤或凋亡时经出芽方式释放的一类直径介于100～1 000 nm的膜性囊泡［4-5］。本研研究主要检测CHD患者外周血中循环EMPs水平和分析EMPs与CHD患者凝血状态之间的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料本研究选取2015年2月1日至2017年8月1日海口市中医医院CHD患者120例。所有患者均经冠状动脉造影、心电图等检测确诊。男性85例，女性35例，年龄45～79岁，平均（59±8.1）岁。120例患者按世界卫生组织分类标准分为：稳定性心绞痛（SA）43例，男32例，女11例，平均（55±5.4）岁 ；不稳定心绞痛（UA）35例，男22例，女14例，平均（58±7.3）岁和急性心肌梗死（AMI）42例，男31例，女11例，平均（57± 6.8）岁 。所有纳入研究的患者均为非血缘关系个体，并排除其他系统疾病，如急性/慢性炎症、创伤、脑梗、周围血管栓塞、恶性肿瘤及严重肝肾疾病等。排除陈旧性心肌梗死（病程6个月以上）。同期体检健康患者20例纳入对照组，其中男12例，女8例，年龄44～76岁，平均（56±6.3）岁。

1.2仪器及设备台式离心机（Centrifuge 5810R，Eppendorf，德国）；流式细胞仪（FACS AriaⅢ，BD，美国）；CD31（1∶200）和Annexin V（1∶200）单克隆抗体购自武汉博士德（武汉），标注珠（碧云天，上海），生化分析仪（日本东芝生化分析仪，南京）。

1.3方法

1.3.1循环微粒的收集（1）用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集CHD患者5 mL静脉血样品；（2）将样品转移至离心管中，4℃条件下，1 550 g离心20 min，取上清；（3）重复步骤（2），取上清，加入上清体积3倍的微粒提取液（锐博生物，广州），充分混匀；（4）4 ℃条件下10 000 g离心10 min，以无菌PBS重悬管底沉淀；（5）重复步骤（4），以150 μL无菌PBS重悬沉淀，即获得CHD患者循环微囊泡。

1.3.2流式细胞术（1）收集循环微粒：自外周血中收集的微粒垂悬于适量PBS中；（2）向微粒垂悬液中加入CD31（1∶200）和CD41（1∶200）单克隆抗体，室温孵育30 min；（3）离心去除多余抗体后以PBS垂悬微粒；（4）加入荧光标记二抗（1∶200），37℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×2次；（5）以400 μL PBS重悬微粒，流式细胞仪检测。

1.3.3总胆固醇（TCHO）、低脂密度脂蛋白（LDL）血脂、血糖、肌酸激酶（CK）和C反应蛋白（CRP）检测采集受试者外周血5 mL，分别检测TCHO、LDL、血脂、血糖、CK和CRP检测等指标检测。

1.4统计学方法应用SPSS 20.0统计软件，计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1冠心病患者基本资料纳入研究的120例CHD患者和20名健康人一般情况见表1。各组患者TCHO、LDL和血糖分析结果显示，健康人、SA、UA、AMI组之间差异无统计学意义。检测正常人和CHD患者外周血CK和CRP的水平后发现，SA、UA和AMI组患者CK和CRP水平明显高于正常人，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1A、1B）。

表1 纳入研究的健康人和CHD患者一般情况Tab.1 General condition of healthy subjects and CHD patients ± s

表1 纳入研究的健康人和CHD患者一般情况Tab.1 General condition of healthy subjects and CHD patients ± s

注：与健康人比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

组别健康人SA UA AMI例数20 43 35 42年龄（岁）56±6.3 55±5.4 58±7.3 57±6.8男性［例（%）］12（60.0）32（74.4）22（62.9）31（73.8）TCHO（mmoL）5.2±0.5 5.3±0.3 5.6±0.8 5.7±0.7 LDL（mmoL）2.2±0.5 2.5±±0.7 2.6±0.4 2.7±0.9血糖（mmoL）5.3±0.6 5.8±0.6 5.7±0.5 5.5±0.4

图1 正常人和CHD患者外周血CRP和CK水平检测Fig.1 The levels of CRP and CK in normal subjects and CHD patients

2.2循环微粒分离与鉴定收集健康人和CHD患者外周血，以试剂盒结合离心法分离外周血中总的循环微粒。向分离所得的微粒悬液中加入直径为1 μm标准珠，流式细胞术分析结果显示，微粒粒径与标准珠接近（图2A），与文献报道的微粒分布范围（100 nm～1 μm）相吻合［6-7］。随后，我们检测了微粒表面特征性分子，如Annexin V和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）［8］。结果发现，分离所得的微粒表面高表达上述两种标志分子（图2B）。以上结果证明，本研究成功的从健康人和CHD外周血中分离得到了循环微粒。

图2 循环微粒分离与鉴定Fig.2 The isolation and identification of circulation MPs

2.3冠心病患者循环EMPs水平及临床意义利用流式细胞仪检测了健康人和CHD患者循环EMPs的水平。本研究采用CD31和Annexin V作为内皮微粒的标志分子。结果发现健康人外周血循环微粒中EMP所占比例为70.02%，而SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs比例分别为78.25%、84.57%和95.36%，明显高于健康人，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3A、3B）。进一步分析健康人和CHD患者外周血中EMPs浓度后发现，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs浓度明显高于健康人，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3C）。

为了探究CHD患者外周血中升高的EMPs水平与同样异常的CK和CRP之间的关系，进行了相关性分析。如图3D和3E所示，SA、UA和AMI型CHD患外周血CK和CRP浓度与EMPs水平具有显著的相关性（P＜0.01），证明CHD患者外周血EMPs水平的升高与提高的CK和CRP浓度具有密切的关系。

2.4冠心病患者外周血EMPs水平与凝血状态之间的关系冠状动脉内血栓是急性冠脉综合症发生的主要原因，而凝血和纤溶功能的异常是促进血栓形成的重要原因［9］。已有文献报道，CHD患者的血液处于高凝状态。因此检测了CHD患者纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和活化部分凝血酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）以验证CHD患者的凝血状态。如图4A所示，SA、UA和AMI型CHD患者FIB较正常人明显提高，而PT和APTT明显低于正常人，差异具有统计学意义（P＜0.05）。为了研究CHD患者外周血EMPs与血液高凝状态之间的关系，将二者进行相关性分析。结果如图4B所示，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs浓度与FIB呈显著正相关（P＜0.01），而与PT和APTT呈显著负相关（P＜0.01）。以上结果证明，CHD患者外周血中升高的EMPs可能参与CHD患者血液高凝状态的形成。

2.5药物治疗降低CHD患者循环EMPs水平所有患者均接受阿司匹林联合阿托伐他汀钙片的常规药物治疗方案。药物治疗2周后收集患者外周血，分离循环微粒，流式细胞术检测CHD患者循环EMPs水平。结果发现，SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs比例分别为75.35%、78.57%和81.23%，低于治疗前的EMPs水平，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图5A、5B）。进一步分析CHD患者外周血中EMPs浓度后发现，药物治疗后，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs浓度明显低于治疗前EMPs浓度，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5C）。

前面的结果提示，EMPs与凝血状态密切相关。因此推测药物治疗后，患者循环EMPs水平降低，必然伴随着凝血状态的改变。本研究收集药物治疗后的CHD患者血液，检测凝血状态。结果发现，SA、UA和AMI型CHD患者FIB较治疗前有明显的下降，而PT和APTT较治疗前明显升，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5D）。

为了进一步验证循环EMPs与CRP和CK之间的关系，检测了药物治疗后的CHD患者血液中的CRP和CK含量。如图6A、6B所示，药物治疗后，CHD患者CRP和CK含量明显低于治疗前水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上结果进一步证明CHD患者外周血中升高的EMPs与CHD患者血液高凝状态和升高的CRP和CK含量有密切的相关性。

图3 冠心病患者循环EMPs水平及与CRP和CK之间的关系Fig.3 The level and of EMPs in CHD patients and the relationship between EMPs and CRP or CK.

3 讨论

随着人们生活水平的提高，生活方式和饮食结构发生了明显的变化，导致CHD在发展中国家的发病率也出现了明显增长的趋势。世界卫生组织曾警告，到2020年，冠状动脉疾病（冠心病）将成为全世界主要的医疗负担［10］。近几十年来，尽管CHD药物治疗指南的广泛推广以及静脉溶栓经皮介入治疗和冠脉搭桥手术日益完善和普及，CHD的治疗有了更多的选择［11-12］。然而，CHD的发病机制仍然不清楚，这给预防CHD带来了极大的挑战。因此研究CHD的发展机制和诊断方法和治疗手段具有重要的现实意义。

目前“内皮损伤反应学说”逐渐成为CHD发病机制的主流学说。该学说认为，血管内皮功能障碍和炎症性反应是CHD关键性的病理特征，即CHD患者存在血管内皮细胞损伤及炎症激活［13-14］。内皮细胞在损伤或激活的状态下将释放EMPs进入血管，导致外周血中EMPs水平的升高［15-16］。因此EMPs可以在一定程度反应CHD的发生和严重程度［17］。本研究发现，SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs的比例和浓度均明显大于健康人（图3A～C）。该结果的意义在于，对于一些特殊原因造成的不宜做冠脉造影的患者，可以辅助检查外周血EMPs水平来辅助诊断CHD。

EMPs可携带母体细胞的膜受体而表达相应受体表型，如 CD31、CD144、CD51、CD54、CD106、CD146、CD105、CD62E和 Annexin V等表面抗原，这些表面抗原可以作为内皮细胞损伤的标记，反映内皮功能障碍［8，17］。但不同的 EMPs表型在不同疾病状态下表现不同的临床意义。CD31阳性的EMPs是CHD发病中常见的标志物［8］。因此本研究采用CD31和Annexin V作为EMPs的标志分子。

图5 药物治疗降低CHD患者循环EMPs水平Fig.5 The level of EMPs in CHD patients were decreased by drug treatment

图6 药物治疗降低CHD患者CRP和CKFig.6 The level of CRP and CK in CHD patients were decreased by drug treatment

本研究不仅发现CHD患者循环EMP水平明显升高，而且发现CHD患者循环EMPs水平的变化总是伴随着CHD患者血液凝固状态和CRP和CK含量的变化：即EMPs水平与FIB、CRP和CK呈显著正相关，而与PT和APTT呈显著负相关（图3、4）。收集药物治疗后患者的外周血，检测后发现循环EMPs水平较治疗前出现明显的下降（图5AC）。因此推测当CHD患者接收药物治疗后，其凝血状态和CRP以及CK水平将出现与EMPs对应的变化。因此本研究检测了药物治疗后CHD患者的FIB、PT、APTT、CRP和CK。结果与预期结果一致，即药物治疗后，CHD患者FIB较治疗前出现明显的下调，而PT和APTT则出现明显的上调（图5D）；CRP和CK均比治疗前出现明显的下调（图6A、6B）。以上结果证实，CHD循环EMPs与CHD患者凝血功能、CRP和CK含量之前存在密切的相关性，并可能参与凝血功能和CRP、CK含量的调节。

综上所述，本研究发现CHD患者循环EMPs水平明显高于健康人，CHD患者循环EMPs与CHD患者的高凝状态和上调的CRP和CK含量密切相关，并可能参与调节CHD患者的凝血状态和CRP以及CK含量，但具体的调节机制需要进一步研究来探究。